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tianmaxk

木虫 (正式写手)

[求助] 欲检测重组蛋白能否被磷酸化

如题,我想重组个含有磷酸化位点的蛋白,然后检测下这个蛋白能否被磷酸化;
如果可以的话有没有什么方法能够确定一下蛋白的磷酸化位点.
请大家多多指教、探讨!
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tianmaxk

木虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by mitocam at 2012-08-24 04:51:06
SDS-PAGE 可以尝试diamond Q染色磷酸化蛋白质。

或用碱性磷酸化酶处理你的样品释放磷酸离子,用Malachite Green 测定是否有磷酸离子从蛋白质释放出来,如果有,说明你的蛋白质有磷酸化。但位点测定还是用质谱分 ...

谢谢回复!
享受美丽人生
4楼2012-08-24 14:38:15
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-24 13:44:42
tianmaxk: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢!追问一下,一般用什么酶对磷酸化位点进行磷酸化?磷酸化位点只有一个能否检测出来? 2012-08-24 14:36:10
试用一下PhosTag SDSPAGE,如果运气好,磷酸化的蛋白质和未磷酸化的(用碱性磷酸化酶处理一下)同时跑胶,看看是否有明显差异。我检测过单个磷酸化位点的蛋白质,分离的很好,很容易就区别出来了。也有蛋白质无法分离的。

测定磷酸化位点,如果有条件可以用质谱分析,分离到磷酸化肽测序。如果上述PhosTag方法可行,突变最可能的磷酸化位点,检验是否点突变消除了磷酸化,这是一个苯方法。
2楼2012-08-24 04:43:19
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-24 13:44:51
SDS-PAGE 可以尝试diamond Q染色磷酸化蛋白质。

或用碱性磷酸化酶处理你的样品释放磷酸离子,用Malachite Green 测定是否有磷酸离子从蛋白质释放出来,如果有,说明你的蛋白质有磷酸化。但位点测定还是用质谱分析最好。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

3楼2012-08-24 04:51:06
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by mitocam at 2012-08-24 04:43:19
试用一下PhosTag SDSPAGE,如果运气好,磷酸化的蛋白质和未磷酸化的(用碱性磷酸化酶处理一下)同时跑胶,看看是否有明显差异。我检测过单个磷酸化位点的蛋白质,分离的很好,很容易就区别出来了。也有蛋白质无法分 ...

用什么蛋白激酶,决定于你的磷酸化位点。如果是PKA,最好用PKA复合体,而不是PKA催化亚基,因为复合体稳定容易保存。

如果用质谱分析,只要带磷酸化位点的肽能否电离并被测序,磷酸化位点就可以被测定。不过测定磷酸化位点还是有点挑战性和需要运气。
5楼2012-08-24 16:23:26
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