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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 14kd的蛋白，做westernblot，电转条件是怎样的
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yxperfect

新虫 (初入文坛)

[求助] 14kd的蛋白，做westernblot，电转条件是怎样的

小分子量蛋白，14kd，1.5mm的胶
电转条件：250mA，湿转，3h30min。
结果只能看到最小分子量26kd的预染Marker，其他大分子量的marker还是看得很清晰的。
是不是转过了啊，，，怎么调整条件，胶有点厚。
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1楼 2012-08-14 17:00:42
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yxperfect

新虫 (初入文坛)
★
wizardfan: 金币+1, 要平时多发帖交流，别临时抱佛脚的来求助。 2012-09-02 07:39:34
做完sds-page，预染Marker的条带都能看到的，包括，11,17两条。。样品的量不多了，所以不能摸条件了。。各位大仙，求经验了~~~~
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2楼2012-08-14 17:04:15
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小韩韩

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2012-08-31 19:32:27
配制15%的胶或梯度胶，1.0mm就行，转印时用湿转60V恒压，一直转两个小时。注意转的过程中电流不要高于180mA。
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3楼2012-08-31 09:33:20
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遥控器68

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2012-08-31 19:32:42
200mA 应该也没问题，一直这样效果也挺不错的
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4楼2012-08-31 10:04:02
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david0308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare: 金币+3, 应助指数+1, 是um不是mm，鼓励新虫发帖交流 2012-08-31 18:19:07
我们实验室 一般会用小分子胶 然后转膜的膜用小孔的，0.2mm而不是普通的0.45mm的，400mA横流2h足够了，如果不会做小分子胶的话就用12%或者15%也行，跑的时间不要太长，在分离胶里跑1h就够了。绝对没有问题的。
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哈哈
5楼2012-08-31 12:37:06
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constra

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我觉得转过了是不太可能的，应该是Marker看不到了而已，我用过100mA过夜也没有问题。用Invitrogen 的NuPage做快转也没问题
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6楼2012-08-31 21:36:53
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废哥117

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2012-09-01 21:07:16
14KD，用15%的胶，你的转膜条件没问题，湿转不存在转过的问题，如果只能看到20KD的条带，那可能是你电泳跑过了，像这种小分子量的蛋白，要注意电泳的条件和时间
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不断提高自己
7楼2012-09-01 16:55:08
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废哥117

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

14KD，用15%的胶，你的转膜条件没问题，湿转不存在转过的问题，如果只能看到20KD的条带，那可能是你电泳跑过了，像这种小分子量的蛋白，要注意电泳的条件和时间
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不断提高自己
8楼2012-09-01 16:55:37
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

【答案】应助回帖

我以前做湿转的时候35kD蛋白，60V，144mA 45min Very Good；
建议你减小电压，缩短时间，再查查你的NC膜截留分子量是多少，能不能做14KD，建议使用0.2umNC膜，不要用0.45的
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坚强面对生活
9楼2012-09-06 10:03:41
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gaorongbest

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-09-07 06:09:52
你的分子量挺小的，一般采用15%的分离胶，而且电泳时注意蓝色条带别跑到玻璃板外面去了；转膜一般是200mA两个半小时，过夜的话80mA就行；电转液要2-3次实验更换新的，祝你实验成功！
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为客户提供更好的科研外包服务：如分子、免疫、病理、细胞培养、动物实验等
10楼2012-09-06 13:59:58
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