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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 小片段双酶切求助，急急急
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 小片段双酶切求助，急急急

最近在做小片段载体的构建，目的片段只有60bp左右，已经成功连接到pMD18-T中，需要双酶切后连接到pET28a中，但是怎么切怎么连都是假阳性，怎么办？
附上双酶切图片，Takara 50bp的marker，感觉小片段好像被切散了，请大家帮忙解决呀，都构建了两个星期了，老大催得紧亚历山大呀！
双酶切体系
质粒   30ul
酶     各1ul
10*buffer    5ul
100*BSA       0.5ul
TE         12.5ul
37℃ 2h

割胶回收的最后一步30ul洗脱，连接
pET28a    1ul
小片段   7ul
T4 ligase   1ul
buffer       1ul
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2012-07-25 16:18:46
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-25 17:15:26
小丹木木: 金币+2, 鼓励热心的虫虫，积极交流经验 2012-07-26 15:22:40
你先看看你的小片段中有没有你的酶切位点，有的话，就得换酶了，还要看看你的酶，酶切反应时间长了是不是有其他的酶切活性。
还有，假阳性你是怎么检测的？提出质粒双酶切的？还是菌落PCR?
你的回收试剂盒是什么？最后一步洗脱是不是量太少了，一般至少得40ul，不然得率会很低。
希望能帮上。
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2楼2012-07-25 16:51:46
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-25 16:51:46
你先看看你的小片段中有没有你的酶切位点，有的话，就得换酶了，还要看看你的酶，酶切反应时间长了是不是有其他的酶切活性。
还有，假阳性你是怎么检测的？提出质粒双酶切的？还是菌落PCR?
你的回收试剂盒是什么？ ...

谢谢。
扩增小片段的时候有添加酶切位点。
酶是新买回来的，酶切时间2h，不知道是不是时间长，因为片段小。
菌落PCR，送测序摇菌都是不成功，不能测序。
用的是生工的试剂盒，因为条带很弱，我不敢用太多洗脱。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
3楼2012-07-25 17:15:02
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-25 20:05:02
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-26 16:41:25
我之前也做过小片段
首先，酶切胶回收时候，用的试剂盒是那个呢？分辨率又是多少呢？可以分辨的最小片段是说少呢？如果量少，多P几管效果会好点。
第二，载体上是否有你的酶切位点呢？一般酶的说明书上，会对小片段或者PCR产物有要求的。
第三，菌落PCR的引物，之前用的时候Tm与现在是否相同呢
希望对你有帮助
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4楼2012-07-25 18:26:48
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+2, ★有帮助, 我是已经构建到T载体上了，现在想切下来连到pET28a里，发现切不下来 2012-07-26 16:42:24
一个简单的办法：直接合成该基因片段：即直接合成该基因片段的正反两条链，注意设计好两端的碱基，保证退火后，直接形成酶切后的黏性末端，因而可以直接连接入pET28载体。很简单，而且成功率高。
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5楼2012-07-25 20:31:31
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+2, ★有帮助 2012-07-26 16:44:16
个人觉得，你的质粒没有提好。
你重新提取下看看。
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6楼2012-07-25 21:12:01
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-26 15:23:02
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-26 16:47:13
引用回帖:
3楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-25 17:15:02
谢谢。
扩增小片段的时候有添加酶切位点。
酶是新买回来的，酶切时间2h，不知道是不是时间长，因为片段小。
菌落PCR，送测序摇菌都是不成功，不能测序。
用的是生工的试剂盒，因为条带很弱，我不敢用太多洗脱。...

酶切位点端，加了保护碱基了吗？
你要看看你的说明书中推荐的反应体系，还有酶切效率。
我建议是不要菌落PCR，直接提质粒，酶切后跑胶，不过你的片段好小，不知道能不能跑得出来。
生工试剂盒不是有个建议洗脱范围嘛，我觉得你那体积还是小了点，个人看法啊。
你说的不能测序，我觉得可能是就没有构建好的质粒，可能是连接过程出问题，而不是酶切过程的问题。
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7楼2012-07-25 21:48:17
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-26 16:47:30
建议你用2%的琼脂糖凝胶试试！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
8楼2012-07-26 08:41:27
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 84146922 at 2012-07-25 18:26:48
我之前也做过小片段
首先，酶切胶回收时候，用的试剂盒是那个呢？分辨率又是多少呢？可以分辨的最小片段是说少呢？如果量少，多P几管效果会好点。
第二，载体上是否有你的酶切位点呢？一般酶的说明书上，会对小片 ...

1.生工的割胶纯化试剂盒，有说<100bp的效率会减少。
2.小片段上有酶切位点，但我没留意酶对小片段有什么特殊要求，等下回去看看
3.我没有做PCR验证因为没有引物，我都直接送测序，但是测序公司说摇菌不成功提不出质粒做测序。
谢谢您宝贵的意见。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
9楼2012-07-26 16:41:14
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-25 21:12:01
个人觉得，你的质粒没有提好。
你重新提取下看看。

是怎么没提取好法？一般要用多少菌液提取，多少洗脱比较合适呢？我用5ml菌液，60ul洗脱，最后也是用试剂盒里面的洗脱液洗脱的。发现10ul跑胶的条带确实不亮。是天根的质粒抽提试剂盒。谢谢
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你的日子如何，你的力量也必如何！
10楼2012-07-26 16:44:08
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