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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 小片段双酶切求助,急急急

最近在做小片段载体的构建,目的片段只有60bp左右,已经成功连接到pMD18-T中,需要双酶切后连接到pET28a中,但是怎么切怎么连都是假阳性,怎么办?
附上双酶切图片,Takara 50bp的marker,感觉小片段好像被切散了,请大家帮忙解决呀,都构建了两个星期了,老大催得紧亚历山大呀!
双酶切体系
质粒   30ul
酶     各1ul
10*buffer    5ul
100*BSA       0.5ul
TE         12.5ul
37℃ 2h

割胶回收的最后一步30ul洗脱,连接
pET28a    1ul
小片段   7ul
T4 ligase   1ul
buffer       1ul
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你的日子如何,你的力量也必如何!
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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sxxuan: 金币+2, 有帮助, 我是已经构建到T载体上了,现在想切下来连到pET28a里,发现切不下来 2012-07-26 16:42:24
一个简单的办法:直接合成该基因片段:即直接合成该基因片段的正反两条链,注意设计好两端的碱基,保证退火后,直接形成酶切后的黏性末端,因而可以直接连接入pET28载体。很简单,而且成功率高。
5楼2012-07-25 20:31:31
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