7楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-25 21:48:17
酶切位点端，加了保护碱基了吗？
你要看看你的说明书中推荐的反应体系，还有酶切效率。
我建议是不要菌落PCR，直接提质粒，酶切后跑胶，不过你的片段好小，不知道能不能跑得出来。
生工试剂盒不是有个建议洗脱范 ...

8楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-26 08:41:27
建议你用2%的琼脂糖凝胶试试！

10楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-26 16:44:08
是怎么没提取好法？一般要用多少菌液提取，多少洗脱比较合适呢？我用5ml菌液，60ul洗脱，最后也是用试剂盒里面的洗脱液洗脱的。发现10ul跑胶的条带确实不亮。是天根的质粒抽提试剂盒。谢谢...

11楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-26 16:47:05
嗯，有加保护碱基。今天尝试了说明书上推荐的体系，结果什么都没有，比之前还差，可能是我的质粒本身就少了。
没有做菌落PCR，都直接挑菌到500ul LB中摇菌然后直接送测序了
连接应该如何呢？我用的是NEB的T4 lig ...

13楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-26 17:00:40
如果你需要质量好的，最好用QIAGEN公司的miniprep 质粒提取试剂盒。
10ml菌液，算是一管。
加水45ul+45ul两次
质粒提取是关键。...

14楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-26 17:01:15
连接，我一般都是算好比例，基本是5:1--10:1，再加等量的buffer，含有T4 ligase，16℃，半小时，再去转化，第二天提质粒，先酶切检验，再送去测序。
你质粒少，不知道摇了多长时间啊？...

16楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-27 10:44:55
我没有检测载体或者片段的浓度，这样怎么算比例比较合适呢？连接半个小时就好了吗？我从来没试过这么短时间的连接呢？
我提取质粒的时候也觉得菌液不浓，但是已经摇过夜了，取了4ml提取，最后60ul洗脱的。...

17楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-27 10:54:40
就是载体和片段的比例，按照1:10来算。
按照一个参照：100ul的PUC18/19,大约是2686bp，按照0.03pmol，大约是50ng。
再比对你的片段大小，算上比例，还有浓度，看加多少。
连接基本是一半片段一半的酶，酶量是过 ...

18楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-27 18:34:19
JM108，就是做的这个才菌液不浓，pET28a也是从JM109中提取出来的浓度就高很多。
载体和片段大小怎么估算还是看不懂呀，求继续赐教呀！...