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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-25 21:48:17
酶切位点端,加了保护碱基了吗?
你要看看你的说明书中推荐的反应体系,还有酶切效率。
我建议是不要菌落PCR,直接提质粒,酶切后跑胶,不过你的片段好小,不知道能不能跑得出来。
生工试剂盒不是有个建议洗脱范 ...

嗯,有加保护碱基。今天尝试了说明书上推荐的体系,结果什么都没有,比之前还差,可能是我的质粒本身就少了。
没有做菌落PCR,都直接挑菌到500ul LB中摇菌然后直接送测序了
连接应该如何呢?我用的是NEB的T4 ligase,是不是连接酶失活了?
你的日子如何,你的力量也必如何!
11楼2012-07-26 16:47:05
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-26 08:41:27
建议你用2%的琼脂糖凝胶试试!

2%回收的时候会不会损失很大?我没试过所以不清楚,谢谢。
你的日子如何,你的力量也必如何!
12楼2012-07-26 16:47:51
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-27 10:41:37
引用回帖:
10楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-26 16:44:08
是怎么没提取好法?一般要用多少菌液提取,多少洗脱比较合适呢?我用5ml菌液,60ul洗脱,最后也是用试剂盒里面的洗脱液洗脱的。发现10ul跑胶的条带确实不亮。是天根的质粒抽提试剂盒。谢谢...

如果你需要质量好的,最好用QIAGEN公司的miniprep 质粒提取试剂盒。
10ml菌液,算是一管。
加水45ul+45ul两次
质粒提取是关键。
13楼2012-07-26 17:00:40
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-07-27 10:45:02
引用回帖:
11楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-26 16:47:05
嗯,有加保护碱基。今天尝试了说明书上推荐的体系,结果什么都没有,比之前还差,可能是我的质粒本身就少了。
没有做菌落PCR,都直接挑菌到500ul LB中摇菌然后直接送测序了
连接应该如何呢?我用的是NEB的T4 lig ...

连接,我一般都是算好比例,基本是5:1--10:1,再加等量的buffer,含有T4 ligase,16℃,半小时,再去转化,第二天提质粒,先酶切检验,再送去测序。
你质粒少,不知道摇了多长时间啊?
14楼2012-07-26 17:01:15
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by yuzhiming at 2012-07-26 17:00:40
如果你需要质量好的,最好用QIAGEN公司的miniprep 质粒提取试剂盒。
10ml菌液,算是一管。
加水45ul+45ul两次
质粒提取是关键。...

原来这样,但是条件不允许卖QIAGEN的呀。不过 平时只用4.5ml的菌液提取质粒,怪不得浓度不够高啦,谢谢
你的日子如何,你的力量也必如何!
15楼2012-07-27 10:41:26
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
14楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-26 17:01:15
连接,我一般都是算好比例,基本是5:1--10:1,再加等量的buffer,含有T4 ligase,16℃,半小时,再去转化,第二天提质粒,先酶切检验,再送去测序。
你质粒少,不知道摇了多长时间啊?...

我没有检测载体或者片段的浓度,这样怎么算比例比较合适呢?连接半个小时就好了吗?我从来没试过这么短时间的连接呢?
我提取质粒的时候也觉得菌液不浓,但是已经摇过夜了,取了4ml提取,最后60ul洗脱的。
你的日子如何,你的力量也必如何!
16楼2012-07-27 10:44:55
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
sxxuan: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-07-27 18:34:28
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-30 13:41:24
引用回帖:
16楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-27 10:44:55
我没有检测载体或者片段的浓度,这样怎么算比例比较合适呢?连接半个小时就好了吗?我从来没试过这么短时间的连接呢?
我提取质粒的时候也觉得菌液不浓,但是已经摇过夜了,取了4ml提取,最后60ul洗脱的。...

就是载体和片段的比例,按照1:10来算。
按照一个参照:100ul的PUC18/19,大约是2686bp,按照0.03pmol,大约是50ng。
再比对你的片段大小,算上比例,还有浓度,看加多少。
连接基本是一半片段一半的酶,酶量是过量的,半个小时就够了。
不知道你提质粒用什么感受态的?top10,DH5α?不然过夜提的,基本都不会很低的。
17楼2012-07-27 10:54:40
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sxxuan

金虫 (著名写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-27 10:54:40
就是载体和片段的比例,按照1:10来算。
按照一个参照:100ul的PUC18/19,大约是2686bp,按照0.03pmol,大约是50ng。
再比对你的片段大小,算上比例,还有浓度,看加多少。
连接基本是一半片段一半的酶,酶量是过 ...

JM108,就是做的这个才菌液不浓,pET28a也是从JM109中提取出来的浓度就高很多。
载体和片段大小怎么估算还是看不懂呀,求继续赐教呀!
你的日子如何,你的力量也必如何!
18楼2012-07-27 18:34:19
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by sxxuan at 2012-07-27 18:34:19
JM108,就是做的这个才菌液不浓,pET28a也是从JM109中提取出来的浓度就高很多。
载体和片段大小怎么估算还是看不懂呀,求继续赐教呀!...

我给你发站内信吧。
19楼2012-07-30 10:07:59
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