应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 小片段双酶切求助，急急急
51/1返回列表
查看: 2585  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 小片段双酶切求助，急急急

最近在做小片段载体的构建，目的片段只有60bp左右，已经成功连接到pMD18-T中，需要双酶切后连接到pET28a中，但是怎么切怎么连都是假阳性，怎么办？
附上双酶切图片，Takara 50bp的marker，感觉小片段好像被切散了，请大家帮忙解决呀，都构建了两个星期了，老大催得紧亚历山大呀！
双酶切体系
质粒   30ul
酶     各1ul
10*buffer    5ul
100*BSA       0.5ul
TE         12.5ul
37℃ 2h

割胶回收的最后一步30ul洗脱，连接
pET28a    1ul
小片段   7ul
T4 ligase   1ul
buffer       1ul
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2012-07-25 16:18:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-07-25 16:51:46
你先看看你的小片段中有没有你的酶切位点，有的话，就得换酶了，还要看看你的酶，酶切反应时间长了是不是有其他的酶切活性。
还有，假阳性你是怎么检测的？提出质粒双酶切的？还是菌落PCR?
你的回收试剂盒是什么？ ...

谢谢。
扩增小片段的时候有添加酶切位点。
酶是新买回来的，酶切时间2h，不知道是不是时间长，因为片段小。
菌落PCR，送测序摇菌都是不成功，不能测序。
用的是生工的试剂盒，因为条带很弱，我不敢用太多洗脱。
赞一下 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
3楼2012-07-25 17:15:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 19 个回答

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-25 17:15:26
小丹木木: 金币+2, 鼓励热心的虫虫，积极交流经验 2012-07-26 15:22:40
你先看看你的小片段中有没有你的酶切位点，有的话，就得换酶了，还要看看你的酶，酶切反应时间长了是不是有其他的酶切活性。
还有，假阳性你是怎么检测的？提出质粒双酶切的？还是菌落PCR?
你的回收试剂盒是什么？最后一步洗脱是不是量太少了，一般至少得40ul，不然得率会很低。
希望能帮上。
赞一下 回复此楼
2楼2012-07-25 16:51:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-25 20:05:02
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-26 16:41:25
我之前也做过小片段
首先，酶切胶回收时候，用的试剂盒是那个呢？分辨率又是多少呢？可以分辨的最小片段是说少呢？如果量少，多P几管效果会好点。
第二，载体上是否有你的酶切位点呢？一般酶的说明书上，会对小片段或者PCR产物有要求的。
第三，菌落PCR的引物，之前用的时候Tm与现在是否相同呢
希望对你有帮助
赞一下 回复此楼
4楼2012-07-25 18:26:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+2, ★有帮助, 我是已经构建到T载体上了，现在想切下来连到pET28a里，发现切不下来 2012-07-26 16:42:24
一个简单的办法：直接合成该基因片段：即直接合成该基因片段的正反两条链，注意设计好两端的碱基，保证退火后，直接形成酶切后的黏性末端，因而可以直接连接入pET28载体。很简单，而且成功率高。
赞一下 回复此楼
5楼2012-07-25 20:31:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 19 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +6 Isak0320 2026-10-12 9/450 2026-10-12 21:13 by Isak0320
[基金申请] 入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍 +6 13108017953 2026-10-08 6/300 2026-10-12 20:07 by w3w3y3
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +4 wangyl_123 2026-10-10 8/400 2026-10-12 18:09 by wangyl_123
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +3 好运来～9527 2026-10-10 6/300 2026-10-12 14:55 by 简单化xn
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
[有机交流] 各位大佬，路线设计求助 +6 zapen 2026-10-08 8/400 2026-10-10 15:59 by zapen
[有机交流] 我应该选哪条合成路线让实验成功率高一些？ +5 jing816y 2026-10-08 9/450 2026-10-10 09:05 by zapen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭