应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于实时定量PCR的问题！！！
111/2返回列表12下一页
查看: 1239  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jia8817091

金虫 (小有名气)

[求助] 关于实时定量PCR的问题！！！

小弟刚开始做real time 。现在有个问题，由于我的模板比较多，40多个，如果每个做2个平行的话就是90个左右。可是我们这bio-rad的荧光PCR是96孔，所以每次只能做一个基因。

我想问：1.可不可以这一次只做目的基因，下一次再全做内参基因呢？
        2.如果目的基因和内参基因的退火温度不一样，能不能一起分析啊？
谢谢大家帮帮我吧！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-07-17 11:16:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
3次重复才可以做统计分析。可以是1个基因+1个内参 一起做3次重复，也可以1个基因+1个内参做完一次，再一次，再一次。样品再多，甚至可以1个基因，1个内参分着做。  还是根据实际情况灵活点。也不能严格的按照统计分析上将的那样做3次重复。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2012-07-17 19:52:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangjianchen

铜虫 (小有名气)
内参基因与目的基因互不影响，可以分开做！
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2012-07-19 16:33:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 12:57:05
那你就做完一次目的基因和内参基因，再做一次，共重复3次。
赞一下 回复此楼
2楼2012-07-17 12:37:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jia8817091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 12:37:48
那你就做完一次目的基因和内参基因，再做一次，共重复3次。

我可能说的不是很清楚，我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度，比如说我的基因1退火58度，内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1，然后第二次再用60度做了同样模板的内参，在保证他们阈值相同的情况下，能否用deltadeltaCt法分析？（问题就是这两基因温度不同，可以吗？）
赞一下 回复此楼
3楼2012-07-17 12:56:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shuanyu0202

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jia8817091: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 18:27:27
一般来说做这种实验内参和目的基因都是同条件处理的，建议取一个比较集中的温度，把一个样本的所有基因都跑完，不行的引物再单独检测，当然同一个模板不同的板子不同的退火温度肯定都要设内参的。
赞一下 回复此楼
4楼2012-07-17 14:00:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 16:07:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-18 13:41:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by jia8817091 at 2012-07-17 12:56:54
我可能说的不是很清楚，我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度，比如说我的基因1退火58度，内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1，然后第二次再用60度做了同样模板的内参， ...

引物差1 ，2 度，Ct值其实是差不多的(扩增产物在这个温度上下浮动范围内都有很好的扩增,也就是目的条带都很亮），做相对定量就是做的一个相对的表达量，如果你不是需要绝度精确的实验数据，高于10倍的表达量和9.8倍的表达量，我认为你在（例如退火58-60度之间）做试验是一样的，也就是说你的内参基因做3次重复就可以了，以后只做目的基因的就OK了
赞一下 回复此楼
5楼2012-07-17 14:42:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jia8817091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 14:42:49
引物差1 ，2 度，Ct值其实是差不多的(扩增产物在这个温度上下浮动范围内都有很好的扩增,也就是目的条带都很亮），做相对定量就是做的一个相对的表达量，如果你不是需要绝度精确的实验数据，高于10倍的表达量和9.8倍 ...

必须要重复三次吗？？这个三次是三个平行？还是分成3次做。。。突然感觉我那40多个模板。。5个目的基因和1个内参。。的工作量好大啊。。。
40*（5+1）*3。。。
赞一下 回复此楼
6楼2012-07-17 16:10:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jia8817091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 19:52:41
3次重复才可以做统计分析。可以是1个基因+1个内参 一起做3次重复，也可以1个基因+1个内参做完一次，再一次，再一次。样品再多，甚至可以1个基因，1个内参分着做。  还是根据实际情况灵活点。也不能严格的按照统计分 ...

谢谢您，还想请教您一个问题。
我这每组都有6，7个样品，如果每个都做，肯定偏差会很大。
但是如果只挑出1~2个，也不能说明问题。我看有些人把一组的几个模板混和在一起，再做几个平行。。。这样可以吗？感觉好像出来的就是这一组的平均了？您说呢？
赞一下 回复此楼
8楼2012-07-17 22:39:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jia8817091 at 2012-07-17 22:39:07
谢谢您，还想请教您一个问题。
我这每组都有6，7个样品，如果每个都做，肯定偏差会很大。
但是如果只挑出1~2个，也不能说明问题。我看有些人把一组的几个模板混和在一起，再做几个平行。。。这样可以吗？感觉好像 ...

多重PCR体系摸索可能要麻烦一些，自己考虑
赞一下 回复此楼
9楼2012-07-18 09:51:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jia8817091 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 焦虑 +9 水冰月月野兔 2026-03-13 13/650 2026-03-19 09:50 by otani
[考研] 求材料调剂 +10 隔壁陈先生 2026-03-12 10/500 2026-03-19 09:15 by 无际的草原
[考研] 本科郑州大学物理学院，一志愿华科070200学硕，346求调剂 +4 我不是一根葱 2026-03-18 4/200 2026-03-19 09:11 by 浮云166
[考研] 能源材料化学课题组招收硕士研究生8-10名 +4 脱颖而出 2026-03-16 11/550 2026-03-19 08:11 by 脱颖而出
[考研] 085410人工智能专硕317求调剂（0854都可以） +3 xbxudjdn 2026-03-18 3/150 2026-03-18 22:14 by zhq0425
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +3 生物工程调剂 2026-03-17 7/350 2026-03-18 20:41 by Wangjingyue
[考研] 一志愿中国海洋大学，生物学，301分，求调剂 +4 1孙悟空 2026-03-17 4/200 2026-03-18 17:59 by fivewind
[考研] 304求调剂 +12 小熊joy 2026-03-14 13/650 2026-03-18 12:34 by Linda Hu
[考研] 293求调剂 +11 zjl的号 2026-03-16 16/800 2026-03-18 08:10 by zhukairuo
[考研] 268求调剂 +7 好运连绵不绝 2026-03-12 8/400 2026-03-17 20:28 by xilongliang
[考研] 材料专硕326求调剂 +6 墨煜姒莘 2026-03-15 7/350 2026-03-17 17:10 by ruiyingmiao
[考研] 290求调剂 +3 p asserby. 2026-03-15 4/200 2026-03-17 16:35 by wangkm
[考研] 26考研求调剂 +6 丶宏Sir 2026-03-13 6/300 2026-03-17 16:13 by 醉在风里
[考研] 一志愿南京大学，080500材料科学与工程，调剂 +4 Jy? 2026-03-16 4/200 2026-03-17 11:02 by gaoqiong
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 0703一志愿211 285分求调剂 +5 ly3471z 2026-03-13 5/250 2026-03-16 16:16 by 哦哦123
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 289求调剂 +4 这么名字咋样 2026-03-14 6/300 2026-03-14 18:58 by userper
[考研] 学硕285求调剂 +13 Wisjxn 2026-03-12 46/2300 2026-03-14 10:33 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +6 Mochaaaa 2026-03-12 7/350 2026-03-13 22:18 by 星空星月
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭