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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于实时定量PCR的问题！！！
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jia8817091

金虫 (小有名气)

[求助] 关于实时定量PCR的问题！！！

小弟刚开始做real time 。现在有个问题，由于我的模板比较多，40多个，如果每个做2个平行的话就是90个左右。可是我们这bio-rad的荧光PCR是96孔，所以每次只能做一个基因。

我想问：1.可不可以这一次只做目的基因，下一次再全做内参基因呢？
        2.如果目的基因和内参基因的退火温度不一样，能不能一起分析啊？
谢谢大家帮帮我吧！
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1楼2012-07-17 11:16:11
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jia8817091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 12:37:48
那你就做完一次目的基因和内参基因，再做一次，共重复3次。

我可能说的不是很清楚，我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度，比如说我的基因1退火58度，内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1，然后第二次再用60度做了同样模板的内参，在保证他们阈值相同的情况下，能否用deltadeltaCt法分析？（问题就是这两基因温度不同，可以吗？）
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3楼2012-07-17 12:56:54
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 12:57:05
那你就做完一次目的基因和内参基因，再做一次，共重复3次。
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2楼2012-07-17 12:37:48
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shuanyu0202

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jia8817091: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 18:27:27
一般来说做这种实验内参和目的基因都是同条件处理的，建议取一个比较集中的温度，把一个样本的所有基因都跑完，不行的引物再单独检测，当然同一个模板不同的板子不同的退火温度肯定都要设内参的。
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4楼2012-07-17 14:00:34
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 16:07:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-18 13:41:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by jia8817091 at 2012-07-17 12:56:54
我可能说的不是很清楚，我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度，比如说我的基因1退火58度，内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1，然后第二次再用60度做了同样模板的内参， ...

引物差1 ，2 度，Ct值其实是差不多的(扩增产物在这个温度上下浮动范围内都有很好的扩增,也就是目的条带都很亮），做相对定量就是做的一个相对的表达量，如果你不是需要绝度精确的实验数据，高于10倍的表达量和9.8倍的表达量，我认为你在（例如退火58-60度之间）做试验是一样的，也就是说你的内参基因做3次重复就可以了，以后只做目的基因的就OK了
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5楼2012-07-17 14:42:49
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