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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于实时定量PCR的问题！！！
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jia8817091

金虫 (小有名气)

[求助] 关于实时定量PCR的问题！！！

小弟刚开始做real time 。现在有个问题，由于我的模板比较多，40多个，如果每个做2个平行的话就是90个左右。可是我们这bio-rad的荧光PCR是96孔，所以每次只能做一个基因。

我想问：1.可不可以这一次只做目的基因，下一次再全做内参基因呢？
        2.如果目的基因和内参基因的退火温度不一样，能不能一起分析啊？
谢谢大家帮帮我吧！
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1楼 2012-07-17 11:16:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
3次重复才可以做统计分析。可以是1个基因+1个内参 一起做3次重复，也可以1个基因+1个内参做完一次，再一次，再一次。样品再多，甚至可以1个基因，1个内参分着做。  还是根据实际情况灵活点。也不能严格的按照统计分析上将的那样做3次重复。
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7楼2012-07-17 19:52:41
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
内参基因与目的基因互不影响，可以分开做！
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10楼2012-07-19 16:33:09
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 12:57:05
那你就做完一次目的基因和内参基因，再做一次，共重复3次。
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2楼2012-07-17 12:37:48
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jia8817091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 12:37:48
那你就做完一次目的基因和内参基因，再做一次，共重复3次。

我可能说的不是很清楚，我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度，比如说我的基因1退火58度，内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1，然后第二次再用60度做了同样模板的内参，在保证他们阈值相同的情况下，能否用deltadeltaCt法分析？（问题就是这两基因温度不同，可以吗？）
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3楼2012-07-17 12:56:54
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shuanyu0202

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jia8817091: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 18:27:27
一般来说做这种实验内参和目的基因都是同条件处理的，建议取一个比较集中的温度，把一个样本的所有基因都跑完，不行的引物再单独检测，当然同一个模板不同的板子不同的退火温度肯定都要设内参的。
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4楼2012-07-17 14:00:34
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 16:07:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-18 13:41:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by jia8817091 at 2012-07-17 12:56:54
我可能说的不是很清楚，我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度，比如说我的基因1退火58度，内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1，然后第二次再用60度做了同样模板的内参， ...

引物差1 ，2 度，Ct值其实是差不多的(扩增产物在这个温度上下浮动范围内都有很好的扩增,也就是目的条带都很亮），做相对定量就是做的一个相对的表达量，如果你不是需要绝度精确的实验数据，高于10倍的表达量和9.8倍的表达量，我认为你在（例如退火58-60度之间）做试验是一样的，也就是说你的内参基因做3次重复就可以了，以后只做目的基因的就OK了
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5楼2012-07-17 14:42:49
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jia8817091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 14:42:49
引物差1 ，2 度，Ct值其实是差不多的(扩增产物在这个温度上下浮动范围内都有很好的扩增,也就是目的条带都很亮），做相对定量就是做的一个相对的表达量，如果你不是需要绝度精确的实验数据，高于10倍的表达量和9.8倍 ...

必须要重复三次吗？？这个三次是三个平行？还是分成3次做。。。突然感觉我那40多个模板。。5个目的基因和1个内参。。的工作量好大啊。。。
40*（5+1）*3。。。
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6楼2012-07-17 16:10:06
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jia8817091

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 19:52:41
3次重复才可以做统计分析。可以是1个基因+1个内参 一起做3次重复，也可以1个基因+1个内参做完一次，再一次，再一次。样品再多，甚至可以1个基因，1个内参分着做。  还是根据实际情况灵活点。也不能严格的按照统计分 ...

谢谢您，还想请教您一个问题。
我这每组都有6，7个样品，如果每个都做，肯定偏差会很大。
但是如果只挑出1~2个，也不能说明问题。我看有些人把一组的几个模板混和在一起，再做几个平行。。。这样可以吗？感觉好像出来的就是这一组的平均了？您说呢？
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8楼2012-07-17 22:39:07
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jia8817091 at 2012-07-17 22:39:07
谢谢您，还想请教您一个问题。
我这每组都有6，7个样品，如果每个都做，肯定偏差会很大。
但是如果只挑出1~2个，也不能说明问题。我看有些人把一组的几个模板混和在一起，再做几个平行。。。这样可以吗？感觉好像 ...

多重PCR体系摸索可能要麻烦一些，自己考虑
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9楼2012-07-18 09:51:56
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