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jia8817091

金虫 (小有名气)

[求助] 关于实时定量PCR的问题!!!

小弟刚开始做real time 。现在有个问题,由于我的模板比较多,40多个,如果每个做2个平行的话就是90个左右。可是我们这bio-rad的荧光PCR是96孔,所以每次只能做一个基因。

我想问:1.可不可以这一次只做目的基因,下一次再全做内参基因呢?
        2.如果目的基因和内参基因的退火温度不一样,能不能一起分析啊?
谢谢大家帮帮我吧!
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shuanyu0202

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
jia8817091: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-07-17 18:27:27
一般来说做这种实验内参和目的基因都是同条件处理的,建议取一个比较集中的温度,把一个样本的所有基因都跑完,不行的引物再单独检测,当然同一个模板不同的板子不同的退火温度肯定都要设内参的。
4楼2012-07-17 14:00:34
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 12:57:05
那你就做完一次目的基因和内参基因,再做一次,共重复3次。
2楼2012-07-17 12:37:48
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jia8817091

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小虫子666 at 2012-07-17 12:37:48
那你就做完一次目的基因和内参基因,再做一次,共重复3次。

我可能说的不是很清楚,我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度,比如说我的基因1退火58度,内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1,然后第二次再用60度做了同样模板的内参,在保证他们阈值相同的情况下,能否用deltadeltaCt法分析?(问题就是这两基因温度不同,可以吗?)
3楼2012-07-17 12:56:54
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jia8817091: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-17 16:07:44
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-18 13:41:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by jia8817091 at 2012-07-17 12:56:54
我可能说的不是很清楚,我的意思是开始我用机器摸出来了几个基因各自的最适退火温度,比如说我的基因1退火58度,内参退火60度。那么我想说我第一次做用58度做了一批基因1,然后第二次再用60度做了同样模板的内参, ...

引物差1 ,2 度,Ct值其实是差不多的(扩增产物在这个温度上下浮动范围内都有很好的扩增,也就是目的条带都很亮),做相对定量就是做的一个相对的表达量,如果你不是需要绝度精确的实验数据,高于10倍的表达量和9.8倍的表达量,我认为你在(例如退火58-60度之间)做试验是一样的,也就是说你的内参基因做3次重复就可以了,以后只做目的基因的就OK了
5楼2012-07-17 14:42:49
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