24小时热门版块排行榜

返回列表

vaivaiann

铜虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 126
红花: 1
帖子: 76
在线: 21.7小时
虫号: 1305162
注册: 2011-05-24
专业: 种群生态学

[求助] 环境样品试剂盒提取宏基因组DNA

我用上海神能博彩的试剂盒K717/K718提取湿地植物根际微生物DNA进行T-RFLP，但是提取后一直检测不到DNA,但是利用细菌通用引物进行PCR扩增能检测到，这样能进行进一步分析吗？是正常的实验过程吗？很多前辈说试剂盒直接提取就应该能检测到的。请有经验的大侠能指教一下。
提取过程如下：
3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2
注：
(a)首次使用前，必须在Wash Solution瓶中加50 ml无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
(b)TE pH8.0或者水均可以用于洗脱，但是用水洗脱效率通常要低一些。
(c)3S柱DNA结合能力大于20ug。
主要用途：
适用于从土壤、动物粪便等环境样品及从其它可以粉碎的固态样品中抽提包括基因组在内的DNA, 也可以从液体样品中抽提DNA。

DNA抽提方法

1.样品准备：I: 如果样品为固体，用合适的工具将样品磨成粉末，取100mg用200ul Solution SUS将样品浸泡、悬浮, 使样品软化分散开。II: 动物粪便或土壤可以直接取100mg，用200ul Solution SUS将样品悬浮起来.III:液体材料如果体积小于200ul,可以直接执行步骤2；液体材料如果体积大于200ul，需要采用合适的方式浓缩到200ul以下,如离心收集液体中固体或离心浓缩等，然后执行步骤2。

2.加入400ul Solution LYS，300mg石英沙，盖上离心管盖，在旋涡振荡器上高速剧烈振荡，10-30分钟或更长的时间。

3.用台式离心机，12,000转/分，室温离心5分钟。

4.将上清完全转移到无菌1.5ml离心管中，加入120ul Solution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀。将溶液用1ml TIP全部转移到3S柱内，柱子放入2ml离心管中，不盖离心管盖，室温放置2分钟以上。

5.盖上离心管盖，12,000转/分，室温离心1分钟。

6.将取下3S柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入600µl Wash Solution, 10,000转/分，室温离心1分钟。

7.重复步骤6一次。

8.取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10,000转/分，室温离心2分钟，以除去残留的Wash Solution。

9.洗脱：在柱子中央加入100µlTE, 将柱子放入新的干净1.5 ml离心管中，室温放置2分钟。12,000转/分，室温离心1分钟。收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可以4°C或-20°C保存。注意：为提高洗脱效率，可以将TE预热到37-55°C。如果样品中基因组DNA含量很低，用30µl TE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。重复该洗脱步骤一次，可以提高产率20%左右。

用分光光度计测量DNA含量按1OD260=50µg DNA，或者用0.8%Agarose 胶判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA。

回复此楼