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380665135

新虫 (初入文坛)

[求助] qPCR引物设计

请问qPCR的引物怎么设计? 我设计过一对, 是在Primer5里search到的,100多bp,引物长度20bp 是在设置的条件下分数最高的一对引物,但是扩增的时候都扩增不出来,只有引物二聚体,求高手指点设计引物的要点,因为我感觉如果全按照那个设计引物规则的话, 基本上没有引物可以用了我以前的引物参数是

下游引物



上游引物



[ Last edited by 380665135 on 2012-7-10 at 20:39 ]
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
看天: 金币+4, 鼓励交流 常来 2012-07-10 23:49:36
我感觉定量的引物尽管要求很高,一般的引物还是可以的。你可以用DNAMAN检测一下发夹结构,最好不要有。退火温度在60度左右就可以了,设计的时候都不是绝对的。实验不行就换就可以了,不过我设的引物按照我上面说的还没有不太好的呢。软件不行你可以手动的前后看看,有时候手动的设比软件好呢。
2楼2012-07-10 22:58:10
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380665135

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by linxi8579 at 2012-07-10 22:58:10
我感觉定量的引物尽管要求很高,一般的引物还是可以的。你可以用DNAMAN检测一下发夹结构,最好不要有。退火温度在60度左右就可以了,设计的时候都不是绝对的。实验不行就换就可以了,不过我设的引物按照我上面说的还 ...

恩  谢谢啦  你也是做的相对定量吗
3楼2012-07-11 10:09:46
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

我们不用Primer5做qPCR引物设计,用oligo,Primer5似乎不行。
4楼2012-07-11 12:31:33
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 380665135 at 2012-07-11 10:09:46
恩  谢谢啦  你也是做的相对定量吗...

嗯哪,其实相对绝对没有本质区别的,只是标准曲线样品不一样而已
5楼2012-07-12 08:50:13
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real-gold

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by linxi8579 at 2012-07-10 22:58:10
我感觉定量的引物尽管要求很高,一般的引物还是可以的。你可以用DNAMAN检测一下发夹结构,最好不要有。退火温度在60度左右就可以了,设计的时候都不是绝对的。实验不行就换就可以了,不过我设的引物按照我上面说的还 ...

你好  请教一下  能简要介绍下如何使用DNAMAN检测发夹结构吗
6楼2012-07-12 17:20:03
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linxi8579

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by real-gold at 2012-07-12 17:20:03
你好  请教一下  能简要介绍下如何使用DNAMAN检测发夹结构吗...

DNAMAN这个软件你木有吗,有的话应该知道的,问一下周围的人吧,我这样说也不好说吧
7楼2012-07-12 22:04:58
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脱水拂空

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果设计引物时实在找不到理想的 你只有那最好的引物试试看 稍微温度调高些
8楼2012-07-13 10:24:24
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
100多的片段不好扩增,你可以跑2%的凝胶看一下,我一直用Primer设计引物,还可以的,最近也要做QPCR,攒人品啊!
9楼2012-07-13 15:18:21
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