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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体，目的基因容易发生SNP，但是699bp有10个之多，是不是有问题，太多了吧？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 构建载体，目的基因容易发生SNP，但是699bp有10个之多，是不是有问题，太多了吧？

从cDNA做PCR,好不容易连上了，但是测序发现有10个序列不对，查到这个基因很容易出现SNP（单核苷酸多态性），去NCBI的SNP数据库查但是看不懂结果。

求高人指导，万分感谢！！！！！！！！！
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1楼 2012-07-08 01:11:48
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
多测几个序列看看是不是都是这些位点的突变。也许NCBI提交的序列本身就有不准确的地方。
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7楼2012-07-08 16:47:14
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普通回帖

sesame_oil

荣誉版主 (文坛精英)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
太专业了。
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2楼2012-07-08 06:30:20
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霹雳光

至尊木虫 (著名写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
我也是刚学分子生物学，得多学习啦
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3楼2012-07-08 09:39:15
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btx362237729

金虫 (正式写手)
没人帮忙啊
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4楼2012-07-08 12:38:50
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547star

木虫 (著名写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
比较一下蛋白质序列看看有多少突变了?
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5楼2012-07-08 13:18:11
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 547star at 2012-07-08 13:18:11
比较一下蛋白质序列看看有多少突变了?

有突变也没办法   SNP我也无法去更改啊
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6楼2012-07-08 15:03:27
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yingying1588

木虫之王 (文学泰斗)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
祝福楼主
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9楼2012-07-08 18:48:42
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凡子1985

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-10 13:42:15
首先搞清楚突变是不是PCR时出现的，　用高保真　低循环数PCR。　一般SNP都是发生在密码子第二或者第三位 这么短的序列不可能SNP频率这么高　　如果真是这样　就值得分析了
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10楼2012-07-08 22:45:11
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微微右旋

金虫 (正式写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
楼主用的什么酶做PCR。PCR条件是什么
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11楼2012-07-09 11:06:55
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 微微右旋 at 2012-07-09 11:06:55
楼主用的什么酶做PCR。PCR条件是什么

Takara的premix。。。PCR是用touch down的产物做的二次PCR
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12楼2012-07-09 11:45:25
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微微右旋

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by btx362237729 at 2012-07-09 11:45:25
Takara的premix。。。PCR是用touch down的产物做的二次PCR...

是酶不行。有错配。如果做SNP就换高保真酶吧。我楼上说的没错。
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13楼2012-07-10 09:36:34
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liuluscl

新虫 (初入文坛)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
takara premix 是taq酶吧，没记错的话，保真度不高，一般做PCR鉴定用那个，做克隆或做snp还是用高保真的pfu比较好吧
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14楼2012-07-10 14:52:31
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
btx362237729(金币+1): 谢谢参与
才不到八百个碱基，完全可以考虑全合成啊，两千多块钱。
PCR、测序，太浪费时间。
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15楼2012-07-10 16:52:01
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cuimao513

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
16楼2012-07-10 16:52:38
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殷殷114

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by 凡子1985 at 2012-07-08 22:45:11
首先搞清楚突变是不是PCR时出现的，　用高保真　低循环数PCR。　一般SNP都是发生在密码子第二或者第三位 这么短的序列不可能SNP频率这么高　　如果真是这样　就值得分析了

有时也会出现很多近距离的SNP位点，我上次做的一个SNP有的只相隔一个碱基
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17楼2012-08-03 17:22:43
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tupac225

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用的什么酶？最好用高保真的pfu酶吧，虽然扩增效率没有普通的酶高，但是突变率很低，另外在切胶连接的时候，紫外的时间不要过长，如果真的这样，很麻烦的，祝你好运吧。
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18楼2012-08-04 08:55:54
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by tupac225 at 2012-08-04 08:55:54
你用的什么酶？最好用高保真的pfu酶吧，虽然扩增效率没有普通的酶高，但是突变率很低，另外在切胶连接的时候，紫外的时间不要过长，如果真的这样，很麻烦的，祝你好运吧。

不可能是酶的问题 序列才这么短。。。也不会是紫外时间过长的问题 因为载体上已经构建好的一段目的基因完全正确   过多的SNP应该是正常发生的 NCBI SNP数据库上这段序列就给出了5个SNP位点
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19楼2012-08-06 13:25:03
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by liuluscl at 2012-07-10 14:52:31
takara premix 是taq酶吧，没记错的话，保真度不高，一般做PCR鉴定用那个，做克隆或做snp还是用高保真的pfu比较好吧

保真度不高 也不至于699bp就出10个突变，之前做过400bp的 一点问题都没有。而且这10个突变点在前200bp就出现了，所以肯定不是酶的问题
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20楼2012-08-06 13:26:24
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 凡子1985 at 2012-07-08 22:45:11
首先搞清楚突变是不是PCR时出现的，　用高保真　低循环数PCR。　一般SNP都是发生在密码子第二或者第三位 这么短的序列不可能SNP频率这么高　　如果真是这样　就值得分析了

目的基因序列是参考的NCBI genBANK数据库，但是它的数据都是源自C57小鼠的，而我的cDNA源自BABL/C品系小鼠，而且目的基因具有容易发生SNP的特性。所以我觉得应该是这里造成的差异。NCBI SNP数据库认为这段序列有5个SNP位点（当然数据来自C57小鼠）。

cDNA为模版做PCR，taq酶很容易发生错配？从前200多bp就开始错不大可能吧
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21楼2012-08-06 13:31:46
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gungunak47

铁虫 (初入文坛)
会不会是单体型
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22楼2012-08-06 14:32:14
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btx362237729

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by gungunak47 at 2012-08-06 14:32:14
会不会是单体型

单体型是什么意思？
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23楼2012-08-06 16:39:02
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7588365968楼
2012-07-08 18:41   回复  
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