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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建载体，目的基因容易发生SNP，但是699bp有10个之多，是不是有问题，太多了吧？
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btx362237729

金虫 (正式写手)

[交流] 构建载体，目的基因容易发生SNP，但是699bp有10个之多，是不是有问题，太多了吧？

从cDNA做PCR,好不容易连上了，但是测序发现有10个序列不对，查到这个基因很容易出现SNP（单核苷酸多态性），去NCBI的SNP数据库查但是看不懂结果。

求高人指导，万分感谢！！！！！！！！！
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1楼 2012-07-08 01:11:48
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btx362237729

金虫 (正式写手)
没人帮忙啊
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4楼2012-07-08 12:38:50
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btx362237729

金虫 (正式写手)
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5楼: Originally posted by 547star at 2012-07-08 13:18:11
比较一下蛋白质序列看看有多少突变了?

有突变也没办法   SNP我也无法去更改啊
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6楼2012-07-08 15:03:27
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btx362237729

金虫 (正式写手)
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11楼: Originally posted by 微微右旋 at 2012-07-09 11:06:55
楼主用的什么酶做PCR。PCR条件是什么

Takara的premix。。。PCR是用touch down的产物做的二次PCR
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12楼2012-07-09 11:45:25
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btx362237729

金虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by tupac225 at 2012-08-04 08:55:54
你用的什么酶？最好用高保真的pfu酶吧，虽然扩增效率没有普通的酶高，但是突变率很低，另外在切胶连接的时候，紫外的时间不要过长，如果真的这样，很麻烦的，祝你好运吧。

不可能是酶的问题 序列才这么短。。。也不会是紫外时间过长的问题 因为载体上已经构建好的一段目的基因完全正确   过多的SNP应该是正常发生的 NCBI SNP数据库上这段序列就给出了5个SNP位点
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19楼2012-08-06 13:25:03
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btx362237729

金虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by liuluscl at 2012-07-10 14:52:31
takara premix 是taq酶吧，没记错的话，保真度不高，一般做PCR鉴定用那个，做克隆或做snp还是用高保真的pfu比较好吧

保真度不高 也不至于699bp就出10个突变，之前做过400bp的 一点问题都没有。而且这10个突变点在前200bp就出现了，所以肯定不是酶的问题
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20楼2012-08-06 13:26:24
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btx362237729

金虫 (正式写手)
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10楼: Originally posted by 凡子1985 at 2012-07-08 22:45:11
首先搞清楚突变是不是PCR时出现的，　用高保真　低循环数PCR。　一般SNP都是发生在密码子第二或者第三位 这么短的序列不可能SNP频率这么高　　如果真是这样　就值得分析了

目的基因序列是参考的NCBI genBANK数据库，但是它的数据都是源自C57小鼠的，而我的cDNA源自BABL/C品系小鼠，而且目的基因具有容易发生SNP的特性。所以我觉得应该是这里造成的差异。NCBI SNP数据库认为这段序列有5个SNP位点（当然数据来自C57小鼠）。

cDNA为模版做PCR，taq酶很容易发生错配？从前200多bp就开始错不大可能吧
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21楼2012-08-06 13:31:46
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btx362237729

金虫 (正式写手)
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22楼: Originally posted by gungunak47 at 2012-08-06 14:32:14
会不会是单体型

单体型是什么意思？
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23楼2012-08-06 16:39:02
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