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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 土壤微生物16s rDNA 18s rDNA 抑制扩增不出来？？？？？？
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shipolande

新虫 (初入文坛)

[求助] 土壤微生物16s rDNA 18s rDNA 抑制扩增不出来？？？？？？

土壤微生物16s rDNA 18s rDNA 一直扩增不出来，微生物总DNA是用试剂盒提取的，图示为土壤提取的DNA模板，可是一直就是P不出来，不知道是什么原因，自己稀释了10倍，50倍，100倍，只有50倍 的稍微有一点条带，但是很不明显，不知道什么原因，请大侠们指点指点 ，小弟不胜感激···········
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shipolande
1楼 2012-07-01 21:12:47
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heavennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 欢迎交流 2012-07-02 22:57:56
1.可能是腐殖质太多，含有钙等金属离子，影响聚合酶活性，需要用螯合剂去除；
2.换一下引物，试一下；
3.退火温度是多少，这也是应该注意的问题。
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5楼2012-07-02 22:33:39
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老夏853

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

pcr 体系里面加1%的 BSA
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8楼2012-09-07 09:38:04
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0609michael

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 老夏853 at 2012-09-07 09:38:04
pcr 体系里面加1%的 BSA

請問是PCR總量體積添加百分之一的BSA就好了嗎?
你通常都怎麼做?
也有的人會使用DMSO或Tween，那添加的比例是怎麼樣呢? 謝謝
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10楼2012-09-18 09:26:57
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普通回帖

maomao1426

木虫 (著名写手)
可能是土壤里腐殖质太多，需要除掉的。
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2楼2012-07-02 08:45:37
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zqk0532

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
因为细菌的GC含量通常比较高，所以建议使用GC buffer P
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3楼2012-07-02 10:10:51
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swaucq

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
总DNA切胶回收纯化过吗？
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不卑不亢
4楼2012-07-02 22:02:40
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plumplumgxc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把DNA模板再处理一下，像切胶回收，酚氯仿抽提，都行
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科研这条道不好走啊。。。
6楼2012-07-04 11:09:01
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tjhyf2012

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
稀释50倍能看到条带，总体来说还是土样中残留的腐殖质影响PCR扩增了。不知道楼主用的试剂盒和引物的信息。不过推荐一个盒子，我们一直用这个提取，石油土壤，火山土壤包括农耕地土壤的总DNA，效果蛮不错的。美国MO bio Ultra clean soil DNA 提取试剂盒。需要仔细阅读里面的troubleshooting，希望能够解决你的问题。
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7楼2012-07-04 14:55:44
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lethebai

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tjhyf2012 at 2012-07-04 14:55:44
稀释50倍能看到条带，总体来说还是土样中残留的腐殖质影响PCR扩增了。不知道楼主用的试剂盒和引物的信息。不过推荐一个盒子，我们一直用这个提取，石油土壤，火山土壤包括农耕地土壤的总DNA，效果蛮不错的。美国MO  ...

请问你是在哪买的？价格在多少？
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9楼2012-09-11 10:40:21
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