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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【SOS】PUC18 SphI和PstI 酶切
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构质粒ING

新虫 (初入文坛)

[求助] 【SOS】PUC18 SphI和PstI 酶切

各位大侠，我现在要用PUC18构建质粒，用到这个载体上的SphI和PstI这两个酶切位点，我需要将目的基因通过这两个位点插入PUC18。通过分析，这两个酶切位点是挨着的，那么
1.如果我使用TAKARA共H buffer同时双酶切的话，可以把这两个酶切位点切开么？
2.我查了一下PstI酶切位点的保护碱基，如果酶切效率大于90的话，是有这两种保护碱基的添加方式：AACTGCAGAACCAATGCATTGG
                        AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA   
我怎么觉得这么诡异呢……  还请大家指点迷津！！
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1楼 2012-06-20 15:38:35
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构质粒ING

新虫 (初入文坛)
另外，有没有战友用TAKARA 的SalI和BamHI共BUFFER酶切过？
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2楼2012-06-20 15:50:51
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
构质粒ING: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-21 10:47:56
1，紧挨着的酶切位点最好分布酶切，不然效率比较低。
2，一般酶切位点的保护碱基只需要额外多出三个碱基就可以了。
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3楼2012-06-20 20:41:00
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jimmy7633

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
构质粒ING: 金币+1 2012-06-21 10:49:52
1.选酶切位点时，尽量离远一点。这样酶切的干净，自连少。像你这种情况就按楼上说的分布酶切。
2.PstI酶切效率还行，你写的都行，主要看下你上下游引物的退火温度，差值尽量控制在3度以内。
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4楼2012-06-20 20:56:21
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构质粒ING

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jqq1985 at 2012-06-20 20:41:00
1，紧挨着的酶切位点最好分布酶切，不然效率比较低。
2，一般酶切位点的保护碱基只需要额外多出三个碱基就可以了。

其他酶切位点的保护碱基都比较正常，就是这个PstI的保护碱基很诡异，我查了一下它的保护碱基，如果加三个的话，酶切效率特别低……
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5楼2012-06-21 10:49:41
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jqq1985

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 构质粒ING at 2012-06-21 10:49:41
其他酶切位点的保护碱基都比较正常，就是这个PstI的保护碱基很诡异，我查了一下它的保护碱基，如果加三个的话，酶切效率特别低……...

哦，是吗。但是takara说明书上说可以的啊。并且我一直都是加ccc作为保护碱基。
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6楼2012-06-21 11:40:49
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魔李粉

木虫 (正式写手)
takara没有SPH1酶   NEB有
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7楼2012-06-22 16:57:31
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 构质粒ING at 2012-06-20 15:50:51
另外，有没有战友用TAKARA 的SalI和BamHI共BUFFER酶切过？

我之前做过，虽然SalI的酶切效率不是很好，但还是最终获得了阳性克隆。我是直接将目的片段和质粒酶切过夜以后跑电泳回收，16℃连接6-12h再做转化。
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8楼2012-12-12 20:40:52
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