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构质粒ING

新虫 (初入文坛)

[求助] 【SOS】PUC18 SphI和PstI 酶切

各位大侠,我现在要用PUC18构建质粒,用到这个载体上的SphI和PstI这两个酶切位点,我需要将目的基因通过这两个位点插入PUC18。通过分析,这两个酶切位点是挨着的,那么
1.如果我使用TAKARA共H buffer同时双酶切的话,可以把这两个酶切位点切开么?
2.我查了一下PstI酶切位点的保护碱基,如果酶切效率大于90的话,是有这两种保护碱基的添加方式:AACTGCAGAACCAATGCATTGG
                        AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA   
我怎么觉得这么诡异呢……  还请大家指点迷津!!
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 构质粒ING at 2012-06-20 15:50:51
另外,有没有战友用TAKARA 的SalI和BamHI共BUFFER酶切过?

我之前做过,虽然SalI的酶切效率不是很好,但还是最终获得了阳性克隆。我是直接将目的片段和质粒酶切过夜以后跑电泳回收,16℃连接6-12h再做转化。
8楼2012-12-12 20:40:52
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构质粒ING

新虫 (初入文坛)

另外,有没有战友用TAKARA 的SalI和BamHI共BUFFER酶切过?
2楼2012-06-20 15:50:51
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
构质粒ING: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-06-21 10:47:56
1,紧挨着的酶切位点最好分布酶切,不然效率比较低。
2,一般酶切位点的保护碱基只需要额外多出三个碱基就可以了。
3楼2012-06-20 20:41:00
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jimmy7633

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
构质粒ING: 金币+1 2012-06-21 10:49:52
1.选酶切位点时,尽量离远一点。这样酶切的干净,自连少。像你这种情况就按楼上说的分布酶切。
2.PstI酶切效率还行,你写的都行,主要看下你上下游引物的退火温度,差值尽量控制在3度以内。
4楼2012-06-20 20:56:21
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