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da_da

金虫 (小有名气)

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[求助] 阳性克隆的鉴定

挑转化后平板上的单菌落提质粒进行鉴定，质粒双酶切正确，PCR鉴定跑胶总没有条带，谁知道什么原因啊，帮帮忙吧！

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心有多大，江湖就有多大！

1楼 2012-06-13 10:55:33

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哇卡卡513

新虫 (初入文坛)

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具体如下：
PCR法：
1.准备好PCR管，加入6ul水/管。
2.用tip头挑起菌落，在1中来回吹吸几次。
3. 在2中用的tip头，可以直接在另一块LB板上划线培养。
4. 加入PCR mixture，PCR鉴定即可。注意做过阳性，阴性对照。
我常用此法做TA克隆鉴定，也可以用于载体构建鉴定，无需提质粒，很实用。
CRACKING法：
1. 将长出的克隆，划线到另一块抗性LB板，培养，使均线长大较为粗大。
2.于PCR管中加入水6ul/管，挑1均线，尽可能挑取，混匀于水中。
3.加入6ul含有loaddingbuffer的2×cracking 液（20%蔗糖＋0.5%SDS+0.5M NaOH），来回吹吸混匀，点样，跑胶即可。
适用于载体构建菌落鉴定，最好是插入片段较大的（大于1kb），好区分。无需酚仿等有毒物质参与，安全！