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hyyws木虫 (正式写手)
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酿酒酵母基因敲除转化问题
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最近在做工业酿酒酵母基因敲除实验，使用的是自己筛选的单倍体菌株，转化A+KanMX+B这个片段进入酿酒酵母基因组（A,B片段分别是酿酒酵母X基因外部上下游同源区），得到X基因缺失的转化子。重组后一方面将KanMX基因引入酵母染色体，使重组菌株产生G418抗性；另一方面，KanMX片段同源重组替换了酵母染色体上的X基因，从而实现该基因的敲除。 碰到的问题是：电转后长出大片的菌落，且菌落很小，挑液体培养基培养却不长。已经多次出现这种问题，调整了电击的压力最后选择了2kv，也做过转化片段的浓度，转过3ug，5ug，都能长，但都是挑出来液体就不长！固体平板和液体培养基的G418含量都是200mg/ml。 望虫友们不吝赐教。 |
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caoluoyuan
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stlion223
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【答案】应助回帖
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大片很小的菌落就是转化不成功的表现 成功的整合Colony会长很大 做integration的时候会出现这样的情况 同意2楼 电转和热转都试一下 虽然一般情况下线性DNA电转要好一点 recover了多久？可以尝试先recover 4个小时，涂一批；4小时后加0.2g/ml G418 然后 recover过夜 再涂一批 DNA的量确实需要比较多 一般lab strain用KanMX做敲除我用1ug 涂1/3 有不到10个CFU 做Delta integration的时候 我回用到20ug 如果工业yeast不好转的话 不妨多用一些 |
3楼2012-06-12 12:03:55