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请教各位大侠：双向电泳蛋白定量用bradford法的问题！！
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双向电泳提肌肉蛋白，提完后用bradford方法测蛋白浓度，但包括标准曲线在内，值不停变动，不知道问题出在哪里，求救！具体方法如下： 用蒸馏水配1mg/ml BSA，各试管分别加入0，10ul，20ul，40ul，60ul，80ul，100ul，用裂解液补齐到100ul。之所以用裂解液，是因为样品是用裂解液溶的，而且裂解液中含有8M的尿素，居然尿素也要跟考马斯亮蓝反应。再加入5ml 考马斯亮蓝，用过试剂盒里的考马斯亮蓝，也自己配过。混匀后立即测，也做过5min后测，10min后测，但在595nm下吸光值不断增大，不稳定。 不知道各位有没有碰到类似的情况？是什么原因造成的呢？这样测出来的蛋白浓度不敢相信啊，只能估测个大概，但后面做双向电泳，是不是还是应该比较准确地定量呢，因为后面结果分析里面，蛋白点差异1.5倍就算是差异蛋白了，如果定量不准确的话，如果是上样原因造成的，那可如何是好啊！由于上样引起的差异是不是可以在后面用软件去掉？ 另，做双向电泳的同学都是用什么方法定量的呢？ 刚开始做，很菜鸟，忘各位不吝赐教，万分感激！ |
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hyacinth326
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6楼2012-05-24 16:32:33