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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教各位大侠：双向电泳蛋白定量用bradford法的问题！！
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wsw2t

银虫 (初入文坛)

[求助] 请教各位大侠：双向电泳蛋白定量用bradford法的问题！！

双向电泳提肌肉蛋白，提完后用bradford方法测蛋白浓度，但包括标准曲线在内，值不停变动，不知道问题出在哪里，求救！具体方法如下：
用蒸馏水配1mg/ml BSA，各试管分别加入0，10ul，20ul，40ul，60ul，80ul，100ul，用裂解液补齐到100ul。之所以用裂解液，是因为样品是用裂解液溶的，而且裂解液中含有8M的尿素，居然尿素也要跟考马斯亮蓝反应。再加入5ml 考马斯亮蓝，用过试剂盒里的考马斯亮蓝，也自己配过。混匀后立即测，也做过5min后测，10min后测，但在595nm下吸光值不断增大，不稳定。
不知道各位有没有碰到类似的情况？是什么原因造成的呢？这样测出来的蛋白浓度不敢相信啊，只能估测个大概，但后面做双向电泳，是不是还是应该比较准确地定量呢，因为后面结果分析里面，蛋白点差异1.5倍就算是差异蛋白了，如果定量不准确的话，如果是上样原因造成的，那可如何是好啊！由于上样引起的差异是不是可以在后面用软件去掉？
另，做双向电泳的同学都是用什么方法定量的呢？
刚开始做，很菜鸟，忘各位不吝赐教，万分感激！
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xiucai_2012

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1楼 2012-05-24 10:40:20
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xiucai_2012

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
我用的是去离子水，考马斯亮蓝再配的时候要过滤，我直接用的是水化液，会反应吗？我感觉相关系数还挺好的啊。
如果有可以跑小板的话买点蛋白质marker，跑个小板的SDS-PAGE，既可以检测浓度，又可以检测纯度
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20楼2012-12-21 22:53:50
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yqbter: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-05-24 10:59:39
不确定是咋回事，但我做的时候补齐100ul是用去离子水。不知道裂解液会不会影响反应。待测样品由于量很少，尿素的影响不会很大。
加入考马斯亮蓝后需要反应5～10min，在30min左右测完。
同一批样品在一起检测，误差是相似的。
定量更主要是为了保证批间差异不至于过大，结果能重复。双向的重复性本来就很差。
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wsw2t
2楼2012-05-24 10:55:18
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xhjggl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不可以使用普通的bradford法，应该用上海生工的非干扰型蛋白浓度测定试剂盒  SK3071
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wsw2t
3楼2012-05-24 11:34:34
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wsw2t

银虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-24 10:55:18:
不确定是咋回事，但我做的时候补齐100ul是用去离子水。不知道裂解液会不会影响反应。待测样品由于量很少，尿素的影响不会很大。
加入考马斯亮蓝后需要反应5～10min，在30min左右测完。
同一批样品在一起检测，误差

那请问你做的时候值稳定吗？你是反应10min后测的？我也做过10min后测，也不稳定。我以前做其他样品的时候，用试剂盒带的标准蛋白测，以及我的样品，值都是稳定的，不知道为什么现在BSA都不稳定。跟BSA的纯度有关系没呢？
谢谢您的回复！欢迎继续交流！
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4楼2012-05-24 14:16:51
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