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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过P450的请进，求帮助
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lilihuang1125

金虫 (初入文坛)

[求助] 做过P450的请进，求帮助 已有1人参与

目前做一个植物P450的体外反应，即把P450基因通过酵母异源表达后，提取微粒体，然后在磷酸钾Buffer中，把底物，微粒体和NADPH一起孵育，一直得不到产物，也尝试过用破碎酵母的总蛋白直接孵育，也以失败告终，不知道哪步出了问题。
基因应该没有问题，因为同时做的体内试验得到了产物。
急，请有经验的同学赐教！！！

[ Last edited by lilihuang1125 on 2012-5-17 at 10:14 ]
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1楼 2012-05-17 09:31:19
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yunshenglmm

铜虫 (小有名气)
遇到同样的问题，痛苦！不知楼主现在做的如何？求帮助
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2楼2014-08-02 00:18:01
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-03 07:57:48
建议首先确定，重组蛋白有表达吗？光SDS-PAGE电泳不能完全确定，最好是WB再做一下
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3楼2014-08-02 12:07:50
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lilihuang1125

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yunshenglmm at 2014-08-02 00:18:01
遇到同样的问题，痛苦！不知楼主现在做的如何？求帮助

你好，我已经做完了，你可以参考一下我的文章，
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm ... Catharanthus+roseus
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4楼2014-08-05 01:32:56
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yunshenglmm

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lilihuang1125 at 2014-08-05 01:32:56
你好，我已经做完了，你可以参考一下我的文章，
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Molecular+characterization+of+the+pentacyclic+triterpenoid+biosynthetic+pathway+in+Catharanthus+roseus...

谢谢楼主，仔细看了一下楼主文章，有两个问题想咨询一下：
1. 楼主为何用粗酶液做酶活，而没有提取酵母微粒体？楼主能否在酵母微粒体提取方面给我点建议，我这边做了N次酵母微粒体提取，都检测不到活性
2. 体外反应为何6h，看了好多文章都是30min搞定
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5楼2014-08-06 20:52:05
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yunshenglmm

铜虫 (小有名气)
谢谢楼主，仔细看了楼主的文章，有以下2问题想咨询一下：
1. 楼主为何没有做酵母微粒体，我做了N次酵母微粒体，都没有检测到活性！楼主能否在酵母微粒体提取方面给我点建议
2. 楼主体外反应时间为何那么长，6h，看了很多文章酶反应30min搞定！
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6楼2014-08-06 20:56:32
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lilihuang1125

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yunshenglmm at 2014-08-06 20:52:05
谢谢楼主，仔细看了一下楼主文章，有两个问题想咨询一下：
1. 楼主为何用粗酶液做酶活，而没有提取酵母微粒体？楼主能否在酵母微粒体提取方面给我点建议，我这边做了N次酵母微粒体提取，都检测不到活性
2. 体外反 ...

Hi，你好
1 这个是实验条件所限了，我们没有超高速离心机，提微粒体不方便，我建议你先测粗提液，有活性了再提微粒体，但是给不了你具体建议了
2 一般纯化的酶30 min反应时间足够了，但是我用的是P450粗提液，一般文献报道都2个小时以上，6个小时的也常见，我就follow了，当然这不是关键，你30分钟能看到活性就不用反应那么久了，呵呵
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7楼2014-08-07 11:21:52
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98177zjs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lilihuang1125 at 2014-08-07 11:21:52
Hi，你好
1 这个是实验条件所限了，我们没有超高速离心机，提微粒体不方便，我建议你先测粗提液，有活性了再提微粒体，但是给不了你具体建议了
2 一般纯化的酶30 min反应时间足够了，但是我用的是P450粗提液，一 ...

前辈你好，能交换点wat11吗，有BY4741、 pesc-leu，或者购买也行，求助啦3q
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8楼2014-11-10 14:28:54
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lilihuang1125 at 2014-08-07 11:21:52
Hi，你好
1 这个是实验条件所限了，我们没有超高速离心机，提微粒体不方便，我建议你先测粗提液，有活性了再提微粒体，但是给不了你具体建议了
2 一般纯化的酶30 min反应时间足够了，但是我用的是P450粗提液，一 ...

你好，我刚刚看到你的文章，有些问题想和你交流一下，方便加一下我的QQ吗？我的QQ是165428287，因为我迟点也要做P450的，所以想请教一下师姐
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9楼2016-06-25 22:43:00
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seraphlx

新虫 (初入文坛)
你确定郭你的微粒体中p450有表达么，因为我跟你情况类似，酵母异源表达，但是用CO差示法检测不到450nm最大吸收，即p450基因无表达，所以怎么可能有反应
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10楼2016-12-20 09:31:02
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