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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 分析前沿 » 【求助】做过巯基DNA接金胶的，有经验的请进啊！
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649251126

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助】做过巯基DNA接金胶的，有经验的请进啊！

实验时将两者混合，放摇床16小时，理论讲AU-S键可以结合。第二天发现金胶变色啦，实验没成功，做了好几次都悲催啦！该实验DNA和金胶有无比例要求？必须加活化剂TCEP吗？请求有经验的朋友指点一下，越详细越好，谢谢！
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1楼 2011-04-05 20:12:44
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Indicator83

木虫 (初入文坛)
你的DNA前期是否处理过呢，带有巯基的DNA是不能拿来直接使用的，用之前要用DTT打开其双硫键（比例为DNA：DTT摩尔浓度比为1：10-100都可），配制成一定浓度的储备液体，备用。
DNA和金胶的浓度并没有一定的比例要求，要根据你的实验自己确定，毕竟一个金胶上接N个DNA和一个金胶接一个DNA比例差的就很大，参考具体文献吧。
我做的金胶和巯基DNA结合，就是摇床12小时，陈化12小时，整个过程避光。
由于金胶接DNA后会使金胶粒径变大，因此颜色会略有变化，因此不建议使用高浓度DNA，一半在10-6M这个浓度左右，至于金胶浓度，你还得自己斟酌。
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2楼2011-04-05 20:59:50
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649251126

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Indicator83 at 2011-04-05 20:59:50:
你的DNA前期是否处理过呢，带有巯基的DNA是不能拿来直接使用的，用之前要用DTT打开其双硫键（比例为DNA：DTT摩尔浓度比为1：10-100都可），配制成一定浓度的储备液体，备用。
DNA和金胶的浓度并没有一定的比例要 ...

以前看文献有用TCEP活化的，但是效果并不是很好啊！问了些师兄师姐，大家说直接连就可以，有些文献也这么说的。感觉效果不好哈！能跟我具体说下你的步骤与注意事项吗？谢谢!
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3楼2011-04-06 12:17:17
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Indicator83

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 649251126 at 2011-04-06 06:17:17:
以前看文献有用TCEP活化的，但是效果并不是很好啊！问了些师兄师姐，大家说直接连就可以，有些文献也这么说的。感觉效果不好哈！能跟我具体说下你的步骤与注意事项吗？谢谢!

其实这还要具体看你买的哪家的DNA的，我们买的DNA要么是赛百盛的，要么是上海生工的，其实带有巯基的DNA巯基端都经过处理，直接用是肯定不行的，一定要经过DTT打断其双硫键，比如你要配置10-6M的溶液，那就是先配置10-4M的DTT缓冲溶液作为稀释溶液，稀释后在摇床上1小时，这时候巯基才露出，不是活化，然后在和金胶连接。可能是你前期处理问题，当然你师兄师姐们的意见也要参考。
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4楼2011-04-06 12:32:42
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649251126

铜虫 (小有名气)
又做了一次，感觉还可以，呵呵。看来加盐老化时快速摇很重要哈！
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5楼2011-04-19 10:35:53
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649251126

铜虫 (小有名气)
你好，你们的DTT是怎么配的啊？
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6楼2011-04-29 09:09:52
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zhoubinzeng

新虫 (初入文坛)
★
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DTT处理好 是怎么纯化的？DTT毒性强 大家有没有用过其替代品TCEP 用它激活巯基时需要临用临配吗
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7楼2011-09-05 11:06:06
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huang6348

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by Indicator83 at 2011-04-05 20:59:50:
你的DNA前期是否处理过呢，带有巯基的DNA是不能拿来直接使用的，用之前要用DTT打开其双硫键（比例为DNA：DTT摩尔浓度比为1：10-100都可），配制成一定浓度的储备液体，备用。
DNA和金胶的浓度并没有一定的比例要 ...

你好，我想问下tcep 用什么配的  有没有相关文献  关于它和dNa 浓度比的
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8楼2011-09-06 11:29:59
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Indicator83

木虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by huang6348 at 2011-09-06 05:29:59:
你好，我想问下tcep 用什么配的  有没有相关文献  关于它和dNa 浓度比的

和你配置DNA的溶剂一致。比如我用0.01M的PBS作为溶剂配置DNA贮备液，那么TCEP也用0.01M的PBS配置。
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9楼2011-09-06 12:24:28
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huang6348

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by Indicator83 at 2011-09-06 12:24:28:
和你配置DNA的溶剂一致。比如我用0.01M的PBS作为溶剂配置DNA贮备液，那么TCEP也用0.01M的PBS配置。

你好，我是想问  比如我想配1uM的DNA 加入的TCEP浓度应该是DNA浓度的多少倍？
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10楼2011-09-06 13:47:44
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Indicator83

木虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by huang6348 at 2011-09-06 07:47:44:
你好，我是想问  比如我想配1uM的DNA 加入的TCEP浓度应该是DNA浓度的多少倍？

TCEP大约100uM，TCEP的浓度是DNA浓度的50-100倍，10倍偏低了点。
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11楼2011-09-07 09:06:53
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Annaliwei

新虫 (初入文坛)
★
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请高人指点，配制DNA的缓冲溶液是不是需要灭菌？
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12楼2012-09-10 16:14:09
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liruizhen007

金虫 (小有名气)
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1208432楼: Originally posted by zhoubinzeng at 2011-09-05 11:06:06
DTT处理好 是怎么纯化的？DTT毒性强 大家有没有用过其替代品TCEP 用它激活巯基时需要临用临配吗

不需要临时配，直接配成50mM溶液和DNA混合30min后放在4摄氏度可以用很久
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13楼2013-01-23 14:22:28
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liruizhen007

金虫 (小有名气)
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1208875楼: Originally posted by huang6348 at 2011-09-06 11:29:59
你好，我想问下tcep 用什么配的  有没有相关文献  关于它和dNa 浓度比的...

直接加水配，50mM
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14楼2013-01-23 14:22:57
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liruizhen007

金虫 (小有名气)
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1276751楼: Originally posted by Annaliwei at 2012-09-10 16:14:09
请高人指点，配制DNA的缓冲溶液是不是需要灭菌？

不用，用去离子水，或者直接买tris-HCl缓冲液
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15楼2013-01-23 14:24:47
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B100-1

铜虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by Indicator83 at 2011-04-05 20:59:50
你的DNA前期是否处理过呢，带有巯基的DNA是不能拿来直接使用的，用之前要用DTT打开其双硫键（比例为DNA：DTT摩尔浓度比为1：10-100都可），配制成一定浓度的储备液体，备用。
DNA和金胶的浓度并没有一定的比例要求 ...

你用的是双链DNA吗，你如何证明DNA有连接上金胶呢，你是讲DNA与金胶先混合12h在加盐陈化是吗，我也有做类似的Au-S连接但是怎么都连不上啊，求赐教啊
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16楼2013-11-06 08:34:08
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Indicator83

木虫 (初入文坛)
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16楼: Originally posted by B100-1 at 2013-11-06 02:34:08
你用的是双链DNA吗，你如何证明DNA有连接上金胶呢，你是讲DNA与金胶先混合12h在加盐陈化是吗，我也有做类似的Au-S连接但是怎么都连不上啊，求赐教啊...

单链人工合成DNA，拍个TEM就可以证明，现在比较成熟的手法。加盐沉化不用太久，否则会引起聚沉。
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17楼2013-11-06 20:45:09
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lcp0802

铜虫 (小有名气)
★
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5楼: Originally posted by 649251126 at 2011-04-19 12:35:53
又做了一次，感觉还可以，呵呵。看来加盐老化时快速摇很重要哈！

Did you use DTT or TCEP to reduce S-S to HS-?
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18楼2014-08-15 18:38:20
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