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铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助】做过巯基DNA接金胶的,有经验的请进啊!

实验时将两者混合,放摇床16小时,理论讲AU-S键可以结合。第二天发现金胶变色啦,实验没成功,做了好几次都悲催啦!该实验DNA和金胶有无比例要求?必须加活化剂TCEP吗?请求有经验的朋友指点一下,越详细越好,谢谢!
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649251126

铜虫 (小有名气)


又做了一次,感觉还可以,呵呵。看来加盐老化时快速摇很重要哈!
5楼2011-04-19 10:35:53
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Indicator83

木虫 (初入文坛)


你的DNA前期是否处理过呢,带有巯基的DNA是不能拿来直接使用的,用之前要用DTT打开其双硫键(比例为DNA:DTT摩尔浓度比为1:10-100都可),配制成一定浓度的储备液体,备用。
DNA和金胶的浓度并没有一定的比例要求,要根据你的实验自己确定,毕竟一个金胶上接N个DNA和一个金胶接一个DNA比例差的就很大,参考具体文献吧。
我做的金胶和巯基DNA结合,就是摇床12小时,陈化12小时,整个过程避光。
由于金胶接DNA后会使金胶粒径变大,因此颜色会略有变化,因此不建议使用高浓度DNA,一半在10-6M这个浓度左右,至于金胶浓度,你还得自己斟酌。
2楼2011-04-05 20:59:50
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649251126

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by Indicator83 at 2011-04-05 20:59:50:
你的DNA前期是否处理过呢,带有巯基的DNA是不能拿来直接使用的,用之前要用DTT打开其双硫键(比例为DNA:DTT摩尔浓度比为1:10-100都可),配制成一定浓度的储备液体,备用。
DNA和金胶的浓度并没有一定的比例要 ...

以前看文献有用TCEP活化的,但是效果并不是很好啊!问了些师兄师姐,大家说直接连就可以,有些文献也这么说的。感觉效果不好哈!能跟我具体说下你的步骤与注意事项吗?谢谢!
3楼2011-04-06 12:17:17
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Indicator83

木虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by 649251126 at 2011-04-06 06:17:17:
以前看文献有用TCEP活化的,但是效果并不是很好啊!问了些师兄师姐,大家说直接连就可以,有些文献也这么说的。感觉效果不好哈!能跟我具体说下你的步骤与注意事项吗?谢谢!

其实这还要具体看你买的哪家的DNA的,我们买的DNA要么是赛百盛的,要么是上海生工的,其实带有巯基的DNA巯基端都经过处理,直接用是肯定不行的,一定要经过DTT打断其双硫键,比如你要配置10-6M的溶液,那就是先配置10-4M的DTT缓冲溶液作为稀释溶液,稀释后在摇床上1小时,这时候巯基才露出,不是活化,然后在和金胶连接。可能是你前期处理问题,当然你师兄师姐们的意见也要参考。
4楼2011-04-06 12:32:42
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