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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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lilihuang1125

金虫 (初入文坛)

[求助] 做过P450的请进,求帮助 已有1人参与

目前做一个植物P450的体外反应,即把P450基因通过酵母异源表达后,提取微粒体,然后在磷酸钾Buffer中,把底物,微粒体和NADPH一起孵育,一直得不到产物,也尝试过用破碎酵母的总蛋白直接孵育,也以失败告终,不知道哪步出了问题。
基因应该没有问题,因为同时做的体内试验得到了产物。
急,请有经验的同学赐教!!!

[ Last edited by lilihuang1125 on 2012-5-17 at 10:14 ]
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lilihuang1125

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yunshenglmm at 2014-08-06 20:52:05
谢谢楼主,仔细看了一下楼主文章,有两个问题想咨询一下:
1. 楼主为何用粗酶液做酶活,而没有提取酵母微粒体?楼主能否在酵母微粒体提取方面给我点建议,我这边做了N次酵母微粒体提取,都检测不到活性
2. 体外反 ...

Hi,你好
1 这个是实验条件所限了,我们没有超高速离心机,提微粒体不方便,我建议你先测粗提液,有活性了再提微粒体,但是给不了你具体建议了
2 一般纯化的酶30 min反应时间足够了,但是我用的是P450粗提液,一般文献报道都2个小时以上,6个小时的也常见,我就follow了,当然这不是关键,你30分钟能看到活性就不用反应那么久了,呵呵
7楼2014-08-07 11:21:52
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yunshenglmm

铜虫 (小有名气)

遇到同样的问题,痛苦!不知楼主现在做的如何?求帮助
2楼2014-08-02 00:18:01
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)


【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-08-03 07:57:48
建议首先确定,重组蛋白有表达吗?光SDS-PAGE电泳不能完全确定,最好是WB再做一下
3楼2014-08-02 12:07:50
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lilihuang1125

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yunshenglmm at 2014-08-02 00:18:01
遇到同样的问题,痛苦!不知楼主现在做的如何?求帮助

你好,我已经做完了,你可以参考一下我的文章,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm ... Catharanthus+roseus
4楼2014-08-05 01:32:56
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