应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助重叠延伸pcr
51/1返回列表
查看: 2227  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助重叠延伸pcr

各位大侠你们好！我最近在做重叠延伸pcr，我现在遇见几个问题想要咨询一下，我要扩增片段的大小是169bp左右，我设计了4条引物，其中P1和P2引物重叠15bp，P3和P4重叠13bp，P2和P3重叠17bp，然后我采用的是P1，P2引物扩增出A片段，P3，P4扩增出B片段，然后分别回收A,B两个片段，再以A和B即为模板又为引物去扩增出目的片段，但是我现在扩增A和B时，老出现有时候扩出来了，有时候就又没了不稳定，还有又一次我分被回收了A和B片段，但是在扩增目的片段时摸索好多条件还是扩不出来，我用的是降落PCR扩片段，哪位高手知道请指点一下呗！不甚感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-05-14 17:09:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-05-14 17:22:17:
我试着理解了你说的，应该是你现在没有扩增片段的模板，你想用四个片段重叠起来，最后得到169bp的片段，以引物和PCR替代基因合成,不知道我理解的是否正确？如果是这样的话，AB应该能扩出来，扩不出来可以增加引物 ...

是的，你理解的是正确的，我现在A,B片段一直出现扩增不稳定的现象，按你说的意思有可能我把引物而具体当成目的片段了，是吧，我需要进行进一步验证，对吗？
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-14 20:26:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-14 18:50:54
我试着理解了你说的，应该是你现在没有扩增片段的模板，你想用四个片段重叠起来，最后得到169bp的片段，以引物和PCR替代基因合成,不知道我理解的是否正确？如果是这样的话，AB应该能扩出来，扩不出来可以增加引物的含量，还有你还需要仔细分辨一下，是引物二聚体还是A、B片段。等你AB进行重叠了之后，把P1和P4引物加上，再做扩增，最后看看有没有169bp的条带。祝你好运。
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-14 17:22:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-17 08:28:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-14 20:26:54:
是的，你理解的是正确的，我现在A,B片段一直出现扩增不稳定的现象，按你说的意思有可能我把引物而具体当成目的片段了，是吧，我需要进行进一步验证，对吗？

貌似我说的也不太确切，可能不叫二聚体吧。。。。。。我的意思是，AB片段都很小，多余的引物啊什么的会自己形成一些乱七八糟的东西，不仔细看你会以为是你的目的条带，所以你要仔细分离，确定得到是A片段和B片段，然后将AB重叠，把P1和P4引物加上，再做扩增。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-14 20:39:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

叶倾意

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-16 08:17:32
[1]首先，你出现这种情况可能是因为你重叠的片段有些短，一般OVERLAP最好大约18bp，我们实验室有个师弟曾经用11个overlap 拼接目的基因，他重叠的区域一般都是20左右。
[2]你设计的A，B片段是不是大小差不多，因为OVERLAP有个很奇怪的现象，拼接的两段最好大小一致，这样在解链和退火的时候会比较一致，不会造成奇奇怪怪的突变错配什么的
[3]你用的是高保真酶么？最好用高保真酶。。。
赞一下 回复此楼
自知者智 自胜者勇 自暴者弃 自强者成
5楼2012-05-15 19:54:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +7 木水思豆 2026-08-25 9/450 2026-08-25 21:50 by gltch
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +15 angus9576 2026-08-25 18/900 2026-08-25 21:23 by 正能量1斤
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 有没有大神帮我看看基金代码 28+4 1234567wang 2026-08-24 10/500 2026-08-25 19:15 by lfy8008
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +20 羊腰板 2026-08-21 23/1150 2026-08-25 16:34 by zsna
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +3 苏东坡二世 2026-08-23 3/150 2026-08-25 10:35 by shisan1313
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +25 yaoyewhu2008 2026-08-20 27/1350 2026-08-25 08:01 by Equinoxhua
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 科研孤儿太难了 +18 我4大白菜 2026-08-20 19/950 2026-08-24 09:47 by 凯恩广盛催化分�
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭