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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助重叠延伸pcr

各位大侠你们好！我最近在做重叠延伸pcr，我现在遇见几个问题想要咨询一下，我要扩增片段的大小是169bp左右，我设计了4条引物，其中P1和P2引物重叠15bp，P3和P4重叠13bp，P2和P3重叠17bp，然后我采用的是P1，P2引物扩增出A片段，P3，P4扩增出B片段，然后分别回收A,B两个片段，再以A和B即为模板又为引物去扩增出目的片段，但是我现在扩增A和B时，老出现有时候扩出来了，有时候就又没了不稳定，还有又一次我分被回收了A和B片段，但是在扩增目的片段时摸索好多条件还是扩不出来，我用的是降落PCR扩片段，哪位高手知道请指点一下呗！不甚感激！
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1楼 2012-05-14 17:09:00
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-05-14 17:22:17:
我试着理解了你说的，应该是你现在没有扩增片段的模板，你想用四个片段重叠起来，最后得到169bp的片段，以引物和PCR替代基因合成,不知道我理解的是否正确？如果是这样的话，AB应该能扩出来，扩不出来可以增加引物 ...

是的，你理解的是正确的，我现在A,B片段一直出现扩增不稳定的现象，按你说的意思有可能我把引物而具体当成目的片段了，是吧，我需要进行进一步验证，对吗？
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3楼2012-05-14 20:26:54
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-14 18:50:54
我试着理解了你说的，应该是你现在没有扩增片段的模板，你想用四个片段重叠起来，最后得到169bp的片段，以引物和PCR替代基因合成,不知道我理解的是否正确？如果是这样的话，AB应该能扩出来，扩不出来可以增加引物的含量，还有你还需要仔细分辨一下，是引物二聚体还是A、B片段。等你AB进行重叠了之后，把P1和P4引物加上，再做扩增，最后看看有没有169bp的条带。祝你好运。
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2楼2012-05-14 17:22:17
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yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-17 08:28:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-14 20:26:54:
是的，你理解的是正确的，我现在A,B片段一直出现扩增不稳定的现象，按你说的意思有可能我把引物而具体当成目的片段了，是吧，我需要进行进一步验证，对吗？

貌似我说的也不太确切，可能不叫二聚体吧。。。。。。我的意思是，AB片段都很小，多余的引物啊什么的会自己形成一些乱七八糟的东西，不仔细看你会以为是你的目的条带，所以你要仔细分离，确定得到是A片段和B片段，然后将AB重叠，把P1和P4引物加上，再做扩增。
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4楼2012-05-14 20:39:16
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叶倾意

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-16 08:17:32
[1]首先，你出现这种情况可能是因为你重叠的片段有些短，一般OVERLAP最好大约18bp，我们实验室有个师弟曾经用11个overlap 拼接目的基因，他重叠的区域一般都是20左右。
[2]你设计的A，B片段是不是大小差不多，因为OVERLAP有个很奇怪的现象，拼接的两段最好大小一致，这样在解链和退火的时候会比较一致，不会造成奇奇怪怪的突变错配什么的
[3]你用的是高保真酶么？最好用高保真酶。。。
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自知者智 自胜者勇 自暴者弃 自强者成
5楼2012-05-15 19:54:59
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