应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助重叠延伸pcr
61/1返回列表
查看: 1799  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助重叠延伸pcr

各位大侠你们好！我最近在做重叠延伸pcr，我现在遇见几个问题想要咨询一下，我要扩增片段的大小是169bp左右，我设计了4条引物，其中P1和P2引物重叠15bp，P3和P4重叠13bp，P2和P3重叠17bp，然后我采用的是P1，P2引物扩增出A片段，P3，P4扩增出B片段，然后分别回收A,B两个片段，再以A和B即为模板又为引物去扩增出目的片段，但是我现在扩增A和B时，老出现有时候扩出来了，有时候就又没了不稳定，还有又一次我分被回收了A和B片段，但是在扩增目的片段时摸索好多条件还是扩不出来，我用的是降落PCR扩片段，哪位高手知道请指点一下呗！不甚感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-05-14 17:09:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-14 18:50:54
我试着理解了你说的，应该是你现在没有扩增片段的模板，你想用四个片段重叠起来，最后得到169bp的片段，以引物和PCR替代基因合成,不知道我理解的是否正确？如果是这样的话，AB应该能扩出来，扩不出来可以增加引物的含量，还有你还需要仔细分辨一下，是引物二聚体还是A、B片段。等你AB进行重叠了之后，把P1和P4引物加上，再做扩增，最后看看有没有169bp的条带。祝你好运。
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-14 17:22:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yyy_zzz at 2012-05-14 17:22:17:
我试着理解了你说的，应该是你现在没有扩增片段的模板，你想用四个片段重叠起来，最后得到169bp的片段，以引物和PCR替代基因合成,不知道我理解的是否正确？如果是这样的话，AB应该能扩出来，扩不出来可以增加引物 ...

是的，你理解的是正确的，我现在A,B片段一直出现扩增不稳定的现象，按你说的意思有可能我把引物而具体当成目的片段了，是吧，我需要进行进一步验证，对吗？
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-14 20:26:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-17 08:28:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by XUMIN6891 at 2012-05-14 20:26:54:
是的，你理解的是正确的，我现在A,B片段一直出现扩增不稳定的现象，按你说的意思有可能我把引物而具体当成目的片段了，是吧，我需要进行进一步验证，对吗？

貌似我说的也不太确切，可能不叫二聚体吧。。。。。。我的意思是，AB片段都很小，多余的引物啊什么的会自己形成一些乱七八糟的东西，不仔细看你会以为是你的目的条带，所以你要仔细分离，确定得到是A片段和B片段，然后将AB重叠，把P1和P4引物加上，再做扩增。
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-14 20:39:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

叶倾意

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-16 08:17:32
[1]首先，你出现这种情况可能是因为你重叠的片段有些短，一般OVERLAP最好大约18bp，我们实验室有个师弟曾经用11个overlap 拼接目的基因，他重叠的区域一般都是20左右。
[2]你设计的A，B片段是不是大小差不多，因为OVERLAP有个很奇怪的现象，拼接的两段最好大小一致，这样在解链和退火的时候会比较一致，不会造成奇奇怪怪的突变错配什么的
[3]你用的是高保真酶么？最好用高保真酶。。。
赞一下 回复此楼
自知者智 自胜者勇 自暴者弃 自强者成
5楼2012-05-15 19:54:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

卷舒_ray

金虫 (小有名气)
疑惑1：169 bp 化学合成不就行了么？
2. 各对引物之间重叠那么多，怎么避免引物二聚体？
3. 还是LZ的问题没表述清楚？
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-17 07:10:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 XUMIN6891 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0703化学调剂 ，六级已过，有科研经历 +14 曦熙兮 2026-03-15 14/700 2026-03-21 19:12 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +5 十三加油 2026-03-21 5/250 2026-03-21 18:48 by 学员8dgXkO
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +11 吃吃吃才有意义 2026-03-19 11/550 2026-03-21 18:23 by 学员8dgXkO
[考研] 317求调剂 +9 申子申申 2026-03-19 15/750 2026-03-21 17:31 by 学员8dgXkO
[考研] 材料 271求调剂 +5 展信悦_ 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:29 by 学员8dgXkO
[考研] 298求调剂 +4 上岸6666@ 2026-03-20 4/200 2026-03-21 17:14 by 学员8dgXkO
[考研] 299求调剂 +5 shxchem 2026-03-20 7/350 2026-03-21 17:09 by ColorlessPI
[考研] 330求调剂0854 +3 assdll 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:01 by 搏击518
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 306求调剂 +4 chuanzhu川烛 2026-03-18 4/200 2026-03-21 08:25 by laoshidan
[考研] 一志愿山大07化学 332分 四六级已过 本科山东双非 求调剂！ +3 不想理你 2026-03-16 3/150 2026-03-21 03:59 by JourneyLucky
[考研] 070300化学319求调剂 +7 锦鲤0909 2026-03-17 7/350 2026-03-21 03:46 by JourneyLucky
[考研] 301求调剂 +10 yy要上岸呀 2026-03-17 10/500 2026-03-21 03:14 by JourneyLucky
[考研] 二本跨考郑大材料306英一数二 +3 z1z2z3879 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:29 by JourneyLucky
[考研] 一志愿华南师大 070300（化学）304分求调剂 +3 0703武芊慧雪304 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:48 by JourneyLucky
[考研] 材料专业求调剂 +6 hanamiko 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:24 by JourneyLucky
[考研] 324求调剂 +5 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 5/250 2026-03-20 22:30 by 促天成
[考博] 招收博士1-2人 +3 QGZDSYS 2026-03-18 3/150 2026-03-20 11:58 by 呱呱呱呱叫
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
[考研] 085601专硕，总分342求调剂，地区不限 +5 share_joy 2026-03-16 5/250 2026-03-18 14:48 by haxia
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭