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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教关于MTT脾淋巴细胞增殖问题
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sunshinejiao

新虫 (初入文坛)

[交流] 请教关于MTT脾淋巴细胞增殖问题

Sample TextSample Text我做脾淋巴细胞增殖实验，无菌取脾，细胞浓度为2*10e6个/ml，96孔板，每孔100μL细胞，加入10μLConA（不同浓度）孵育72小时后，加入MTT（5mg/ml）再孵育4个小时，没有出现甲瓒结晶，在显微镜下观察，细胞还是透亮的，没有发生任何变化。我又做了一次试验，取完脾细胞，孵育20小时，直接加MTT，孵育4h，有甲瓒结晶，但是很少，而且细胞还是透亮的。我想请教各位，脾细胞在96孔板里，死细胞和活细胞怎么区分啊?我那细胞都是透亮的。还有我加入MTT没有甲瓒结晶，能说明我的细胞全部死亡了吗（MTT我用其他细胞验证过，没有问题）？非常感谢各位的回答!
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1楼 2012-05-11 10:36:01
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
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看天: 金币+4, 鼓励分享和交流 2012-05-13 00:07:45
取的新鲜组织，脾细胞还是比较混杂的，怎么确定是淋巴细胞呢？分选了？还有你裂红吗？
MTT像你说的，做其他细胞没问题，那说明还是你的细胞的事。
至于死活，那你多铺几个孔，吸出来，胎盘蓝染染看细胞死了没

[ Last edited by telomerase on 2012-5-12 at 00:13 ]
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2楼2012-05-12 00:12:31
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sunshinejiao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by telomerase at 2012-05-12 00:12:31:
取的新鲜组织，脾细胞还是比较混杂的，怎么确定是淋巴细胞呢？分选了？还有你裂红吗？
MTT像你说的，做其他细胞没问题，那说明还是你的细胞的事。
至于死活，那你多铺几个孔，吸出来，胎盘蓝染染看细胞死了没

谢谢您的回答！
    我没有分选，也没有裂红，就直接取出来用ConA刺激，又做了一次，有一些甲瓒结晶，但还是有的孔没有，我觉得也是取细胞时候出了问题。
    还想问一下，细胞在96孔板里，还是贴壁了，能把细胞吸出来吗？
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3楼2012-05-12 16:43:40
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我没养过你的这个细胞
贴不贴壁，不是问题，贴了的可以消化啊，就是繁琐点而已
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4楼2012-05-12 20:02:22
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看天: 金币+2, 鼓励 常来 2012-05-13 00:07:55
增值细胞做MTT，你的密度是不是高了点啊，最高查一下相关文献，看别人用多少细胞。教材上应该是推荐1000-10000cells/well
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5楼2012-05-12 21:24:46
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sunshinejiao

新虫 (初入文坛)
silicare: , 1.0-0.2ml/well 2012-05-19 10:22:43
引用回帖:
5楼: Originally posted by 神经再生 at 2012-05-12 21:24:46:
增值细胞做MTT，你的密度是不是高了点啊，最高查一下相关文献，看别人用多少细胞。教材上应该是推荐1000-10000cells/well

看的英文文献都是2*10e6个/ml
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6楼2012-05-13 21:40:44
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神经再生

铁杆木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by sunshinejiao at 2012-05-13 21:40:44:
看的英文文献都是2*10e6个/ml

可以做一个标准曲线试试
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7楼2012-05-18 16:48:27
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zhuhuiling21

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问楼主 在加DMSO之前要弃去上清吧 怎么可以做可以使每空弃去的上清差不多 不至于使结果差异很大
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8楼2012-09-12 11:37:56
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gaorongbest

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我看了你的实验后觉得有问题啊：1、取脾后要很多步骤才能得到淋巴细胞的（PBS冲洗就免说了，至少要用红细胞裂解液裂解红细胞、用Percoll分离液分离淋巴细胞）2、一个大鼠脾脏一般接种一个96孔板，每孔100μL细胞，我们的组织是提前用培养基浸润的；3、孵育4h，可以在显微镜下看到明显的蓝紫色4、因为淋巴细胞是半贴壁的，所以要把每孔细胞吸到EP管后离心，测OD值得
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9楼2012-09-19 16:10:02
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熊拉拉

新虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
9楼: Originally posted by gaorongbest at 2012-09-19 16:10:02
我看了你的实验后觉得有问题啊：1、取脾后要很多步骤才能得到淋巴细胞的（PBS冲洗就免说了，至少要用红细胞裂解液裂解红细胞、用Percoll分离液分离淋巴细胞）2、一个大鼠脾脏一般接种一个96孔板，每孔100μL细胞，我 ...

贴壁的细胞要怎么处理呢？吹打？还有加药之后培育多久？我用的是24小时
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10楼2014-01-16 10:24:28
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檀香木2

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
估计你刺激原浓度太低，我们实验时ConA用进口的，终浓度4微克。
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11楼2015-04-03 19:46:33
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左左巧乐兹

新虫 (初入文坛)
★
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3楼: Originally posted by sunshinejiao at 2012-05-12 16:43:40
谢谢您的回答！
    我没有分选，也没有裂红，就直接取出来用ConA刺激，又做了一次，有一些甲瓒结晶，但还是有的孔没有，我觉得也是取细胞时候出了问题。
    还想问一下，细胞在96孔板里，还是贴壁了，能把细胞 ...

??怎么会是贴壁细胞呢？？？
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12楼2016-06-20 19:22:34
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