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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 淋巴细胞增殖实验（MTT法）中的几个问题
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summer0702

新虫 (小有名气)

[求助] 淋巴细胞增殖实验（MTT法）中的几个问题

本人之前曾经做过淋巴细胞转化实验，用的是自己配制的培养基，这次再做之后，发现淋巴细胞始终无法被转化成淋巴母细胞，原因无法找出，有知道原因者能否告之，不胜感激！具体实验步骤如下：
1.取18-22克小白鼠脾淋巴细胞，调整浓度为2*10的六次方，其它浓度也有做，但是也未能获得成功。加入96孔板，每孔100ul,加入CONA或PHA 50ul，CON A终浓度分别为5,10,20ug/ML，PHA终浓度分别为10,20,40ug/ml.加入含10%小牛血清的1640培养基50ul.
2.以加入100ul细胞悬液和100ul含10%小牛血清作为空白对照
3.96孔板分别加入100ul细胞悬液,50ul实验药物溶液和50ul含10%小牛血清的1640.
4.于37度，5%CO2培养72小时，加入MTT（5mg/ml)20ul,培养4小时后进行OD570测定。
     淋巴细胞始终未能被转化为淋巴母细胞，原因未能找到，是实验动物的问题，还是培养基的问题，还是刺激源的问题？哪位前辈能够指点迷津，谢谢了！
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1楼 2011-08-16 09:18:41
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mafang68

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
summer0702(金币+3): 谢谢你的意见！分离时你也是用PBS的吗？不是用Hank's?；有没有遇到MTT不能被PBS溶解的问题！ 2011-08-16 10:04:46
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流 2011-08-16 10:33:21
summer0702(金币+2): 2011-09-17 16:11:35
我以前做过淋巴细胞的增殖试验，主要心得在于分离提取的细胞状态好，试验就做的好。跟你交流一下经验：
1.小鼠，我用的是C57，小白鼠主要是体液应答为主
2.培养的血清，用的是10%胎牛的
3.分离细胞尤其要注意，快，快，再快！尽量减少细胞在外界的时间。分离时用的PBS也是加了血清的
4.还有一条最关键，培养时细胞的浓度，我做的没有低于1*107，淋巴细胞小，多点没关系
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木虫啦，哈哈
2楼2011-08-16 09:41:49
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summer0702

新虫 (小有名气)
有没有遇到MTT不被PBS溶解的问题，怎么解决？不同的厂家是否差别很大！你们有做成功的用的是哪个厂家的呢？另外，培养基用的是哪种1640？谢谢！
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3楼2011-08-16 10:06:41
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mafang68

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢分享 2011-08-16 10:34:00
呵呵，因为实验室都用PBS，所以懒得再配HANKS液了，
还没碰到过不溶的，就是时间很长，记得有一次搅了快俩小时。配的时候记得避光，用无菌PBS配
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木虫啦，哈哈
4楼2011-08-16 10:10:14
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summer0702

新虫 (小有名气)
你们实验室用的是哪种1640呢？能否告知？是粉末还是直接配好的？
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5楼2011-08-16 10:14:35
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梧桐如雪

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-08-17 00:11:37
1640用gibco的就行，我都买现成的液体，因为以前公司水质不好，细胞长不好。MTT用sigma的。用了很多家，比较得出的。好溶，稳定性好。
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6楼2011-08-16 22:30:36
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