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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 质粒PCR大小正确，可是双酶切切不开
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fannyzehong

银虫 (初入文坛)

[求助] 质粒PCR大小正确，可是双酶切切不开

我将目的基因3.5kb大小连接至表达载体，提取质粒，用目的基因引物做质粒PCR，大小正确，但是双酶切却看不到目的条带。为什么？
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1楼 2012-05-10 18:39:39
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:00:45
有可能酶切出问题，比喻酶活性，可能双酶切里面一个酶的活性达不到100%影响了酶切。可以分别单酶切，和没有酶切的质粒点在一起跑胶，大小不是很大可一般可以看得出来有没有切开
如果酶切没有问题就有可能是酶切位点出问题了，比喻甲基化了，酶就无法识别了，也可能在扩增的过程中酶切位点突变了，还有就是用同尾酶时连上去后就酶切位点就给破坏掉了
再一种可能就是你的质粒问题，比喻是杂菌，不是目的质粒，建议跑胶看看质粒大小，还有就是质粒不纯，杂蛋白太多也会影响酶切，建议重新抽提
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6楼2012-05-14 20:37:34
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vir2008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:24
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:35
PCR假阳性比较多，建议测序看看是怎么回事。
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2楼2012-05-10 23:36:55
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:07
是不是酶失效了？换一管新的试试看。
还有酶切时间够不够？
酶切体系合适不合适？
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
3楼2012-05-11 09:12:51
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
需要考虑两方面原因：
1、提取的重组质粒是否纯化，如果有残余苯酚氯仿等杂质，限制酶酶切时可能切不动。
2、酶切体系中酶是否失活，体系大小是否合适，相对样品DNA量的酶用量是否合适，酶切时间是否足够
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4楼2012-05-11 22:45:02
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