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fannyzehong

银虫 (初入文坛)

[求助] 质粒PCR大小正确,可是双酶切切不开

我将目的基因3.5kb大小连接至表达载体,提取质粒,用目的基因引物做质粒PCR,大小正确,但是双酶切却看不到目的条带。为什么?
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:07
是不是酶失效了?换一管新的试试看。
还有酶切时间够不够?
酶切体系合适不合适?
勤奋、执着、专注,则无坚不破。
3楼2012-05-11 09:12:51
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vir2008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:24
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:35
PCR假阳性比较多,建议测序看看是怎么回事。
2楼2012-05-10 23:36:55
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
需要考虑两方面原因:
1、提取的重组质粒是否纯化,如果有残余苯酚氯仿等杂质,限制酶酶切时可能切不动。
2、酶切体系中酶是否失活,体系大小是否合适,相对样品DNA量的酶用量是否合适,酶切时间是否足够
4楼2012-05-11 22:45:02
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威风之狼

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:00:29
酶切位点 也是要考虑的因素
5楼2012-05-13 21:05:11
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