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fannyzehong

银虫 (初入文坛)

[求助] 质粒PCR大小正确,可是双酶切切不开

我将目的基因3.5kb大小连接至表达载体,提取质粒,用目的基因引物做质粒PCR,大小正确,但是双酶切却看不到目的条带。为什么?
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vir2008

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:24
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:35
PCR假阳性比较多,建议测序看看是怎么回事。
2楼2012-05-10 23:36:55
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:01:07
是不是酶失效了?换一管新的试试看。
还有酶切时间够不够?
酶切体系合适不合适?
勤奋、执着、专注,则无坚不破。
3楼2012-05-11 09:12:51
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
需要考虑两方面原因:
1、提取的重组质粒是否纯化,如果有残余苯酚氯仿等杂质,限制酶酶切时可能切不动。
2、酶切体系中酶是否失活,体系大小是否合适,相对样品DNA量的酶用量是否合适,酶切时间是否足够
4楼2012-05-11 22:45:02
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威风之狼

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:00:29
酶切位点 也是要考虑的因素
5楼2012-05-13 21:05:11
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


fannyzehong: 金币+1 2012-05-21 08:00:45
有可能酶切出问题,比喻酶活性,可能双酶切里面一个酶的活性达不到100%影响了酶切。可以分别单酶切,和没有酶切的质粒点在一起跑胶,大小不是很大可一般可以看得出来有没有切开
如果酶切没有问题就有可能是酶切位点出问题了,比喻甲基化了,酶就无法识别了,也可能在扩增的过程中酶切位点突变了,还有就是用同尾酶时连上去后就酶切位点就给破坏掉了
再一种可能就是你的质粒问题,比喻是杂菌,不是目的质粒,建议跑胶看看质粒大小,还有就是质粒不纯,杂蛋白太多也会影响酶切,建议重新抽提
6楼2012-05-14 20:37:34
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)

同意6楼的观点,我想问你你连3500bp的片段用的什么载体啊,好连吗
7楼2012-05-15 14:24:14
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chenxiang29

银虫 (正式写手)

我也出现过同样的问题,换了pcr试剂后不出现目的条带,可见原来的试剂盒污染了
smile to the world
8楼2012-10-25 20:41:05
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haitai2011

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

9楼2013-07-09 11:13:22
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