应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组蛋白含半胱氨酸纯化过程如何保护巯基
151/2返回列表12下一页
查看: 2835  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 重组蛋白含半胱氨酸纯化过程如何保护巯基

如题，大肠杆菌中表达小分子量蛋白（90AA），含5个半胱氨酸，半胱氨酸是活性作用位点，如何保证蛋白纯化过程巯基不被氧化？
（蛋白含His-tag需要Ni-NTA柱子纯化，但柱子耐DTT仅5mM,耐巯基乙醇20mM）
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-05-10 10:41:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-10 20:21:42
baby1_9253344: 金币+2 2012-05-11 20:37:24
本帖内容被屏蔽
2楼2012-05-10 13:00:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 13:00:36:
你的半胱氨酸是游离的吗？很多蛋白的半胱氨酸都是以二硫键的形式存在。而且你的纯化过程需要加DDT吗？我了解到很多的蛋白质一般没有加DDT保护，即使存在未结合的半胱氨酸。而且，你确信你的产品在镍柱纯化过程中会 ...

文献中蛋白是以游离状态才有活性的。
现在的情况是蛋白在菌体里时是有预期效果的，但是纯化后没有预期效果的，那么蛋白应该还是正确表达了，但是在纯化过程中发生变化了。
设想加DTT等还原剂也是为了排除过程中被氧化的可能性。但是具体怎么操作，不是很了解，所以想请高手解答一下。
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-10 15:28:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王龙辉

禁言 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
telomerase: 应助指数-1, 违规存档, 请不要刷应助指数，谢谢！ 2012-05-10 20:20:35
本帖内容被屏蔽
4楼2012-05-10 16:04:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

danbomingyue

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2012-05-10 16:21:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★
baby1_9253344: 金币+2 2012-05-11 20:37:44
本帖内容被屏蔽
6楼2012-05-10 16:27:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 16:21:45:
你的产品可否在回收以后再加入DDT还原？酸性条件下分离纯化也是被氧化吗？有没有尝试过？

酸性的话小于巯基等电点就可以吗？比如pH6？这个没试过，我是新手。。。蛋白纯化都是头一次做。。。binding buffer和洗脱剂都是pH8的。
赞一下 回复此楼
7楼2012-05-10 16:28:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 16:27:35:
而且始终存在着被氧化的可能性啊。另外，没有活性活性是因为二硫键错配的原因呢？加入巯基乙醇或者DDT，然后通过稀释法复性，测试一下活性怎么样，确定是不是二硫键错配导致的失活。

请问~这个还原剂的浓度大概多大合适呢？就是多大浓度才能起到还原作用呢？太大了的话是不是会不可逆变性啊？

另，
文献中我这类蛋白他们用的是肝素亲和柱纯化的，洗脱剂都是含巯基乙醇的，不晓得是什么tag。我的是his-tag,因为不是生物专业的，所以不想换tag了，太麻烦了。。。
赞一下 回复此楼
8楼2012-05-10 16:48:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

danbomingyue

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-05-12 11:10:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shawne2008

木虫 (著名写手)

木虫反贪局局长

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
baby1_9253344: 金币+2 2012-05-12 18:59:03
加入CGSH看看有没有效果吧，有CGSH的还原力情况下不会形成二硫键
赞一下 回复此楼
10楼2012-05-12 17:35:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 baby1_9253344 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 295复试调剂 +4 简木ChuFront 2026-03-19 4/200 2026-03-20 09:33 by yuncha
[考研] 295材料求调剂，一志愿武汉理工085601专硕 +3 Charlieyq 2026-03-19 3/150 2026-03-20 08:53 by xingguangj
[考研] 0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章 +20 rare12345 2026-03-18 20/1000 2026-03-20 08:42 by 无际的草原
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-19 5/250 2026-03-19 23:51 by 23Postgrad
[考研] 一志愿苏州大学材料求调剂，总分315（英一） +3 sbdksD 2026-03-19 3/150 2026-03-19 23:21 by fmesaito
[考研] 307求调剂 +9 冷笙123 2026-03-17 9/450 2026-03-19 22:44 by 学员8dgXkO
[考研] 复试调剂 +4 z1z2z3879 2026-03-14 6/300 2026-03-19 17:18 by fei626-918
[考研] 一志愿天津大学化学工艺专业（081702）315分求调剂 +11 yangfz 2026-03-17 11/550 2026-03-19 15:06 by houyaoxu
[考研] 346求调剂[0856] +3 WayneLim327 2026-03-16 6/300 2026-03-19 11:21 by WayneLim327
[考研] 一志愿中海洋材料工程专硕330分求调剂 +7 小材化本科 2026-03-18 7/350 2026-03-19 10:46 by Linda Hu
[考研] 332求调剂 +3 ydfyh 2026-03-17 3/150 2026-03-19 10:14 by 功夫疯狂
[教师之家] 焦虑 +9 水冰月月野兔 2026-03-13 13/650 2026-03-19 09:50 by otani
[考研] 一志愿武理材料305分求调剂 +5 想上岸的鲤鱼 2026-03-18 6/300 2026-03-18 17:53 by 无际的草原
[考研] 312求调剂 +8 陌宸希 2026-03-16 9/450 2026-03-18 12:39 by Linda Hu
[考研] 0703化学求调剂 总分331 +3 ZY-05 2026-03-13 3/150 2026-03-18 10:58 by macy2011
[考研] 334求调剂 +3 志存高远意在机� 2026-03-16 3/150 2026-03-18 08:34 by lm4875102
[考研] 085601求调剂 +4 Du.11 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:08 by ruiyingmiao
[考研] 274求调剂 +5 时间点 2026-03-13 5/250 2026-03-17 07:34 by 热情沙漠
[基金申请] 今年的国基金是打分制吗？ 50+3 zhanghaozhu 2026-03-14 3/150 2026-03-16 17:07 by 北京莱茵润色
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭