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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 重组蛋白含半胱氨酸纯化过程如何保护巯基

如题,大肠杆菌中表达小分子量蛋白(90AA),含5个半胱氨酸,半胱氨酸是活性作用位点,如何保证蛋白纯化过程巯基不被氧化?
(蛋白含His-tag需要Ni-NTA柱子纯化,但柱子耐DTT仅5mM,耐巯基乙醇20mM)
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 16:27:35:
而且始终存在着被氧化的可能性啊。另外,没有活性活性是因为二硫键错配的原因呢?加入巯基乙醇或者DDT,然后通过稀释法复性,测试一下活性怎么样,确定是不是二硫键错配导致的失活。

请问~这个还原剂的浓度大概多大合适呢?就是多大浓度才能起到还原作用呢?太大了的话是不是会不可逆变性啊?

另,
文献中我这类蛋白他们用的是肝素亲和柱纯化的,洗脱剂都是含巯基乙醇的,不晓得是什么tag。我的是his-tag,因为不是生物专业的,所以不想换tag了,太麻烦了。。。
8楼2012-05-10 16:48:01
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-10 20:21:42
baby1_9253344: 金币+2 2012-05-11 20:37:24
本帖内容被屏蔽

2楼2012-05-10 13:00:36
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 13:00:36:
你的半胱氨酸是游离的吗?很多蛋白的半胱氨酸都是以二硫键的形式存在。而且你的纯化过程需要加DDT吗?我了解到很多的蛋白质一般没有加DDT保护,即使存在未结合的半胱氨酸。而且,你确信你的产品在镍柱纯化过程中会 ...

文献中蛋白是以游离状态才有活性的。
现在的情况是蛋白在菌体里时是有预期效果的,但是纯化后没有预期效果的,那么蛋白应该还是正确表达了,但是在纯化过程中发生变化了。
设想加DTT等还原剂也是为了排除过程中被氧化的可能性。但是具体怎么操作,不是很了解,所以想请高手解答一下。
3楼2012-05-10 15:28:48
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王龙辉

禁言 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
telomerase: 应助指数-1, 违规存档, 请不要刷应助指数,谢谢! 2012-05-10 20:20:35
本帖内容被屏蔽

4楼2012-05-10 16:04:46
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