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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组蛋白含半胱氨酸纯化过程如何保护巯基
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 重组蛋白含半胱氨酸纯化过程如何保护巯基

如题，大肠杆菌中表达小分子量蛋白（90AA），含5个半胱氨酸，半胱氨酸是活性作用位点，如何保证蛋白纯化过程巯基不被氧化？
（蛋白含His-tag需要Ni-NTA柱子纯化，但柱子耐DTT仅5mM,耐巯基乙醇20mM）
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1楼 2012-05-10 10:41:24
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-10 20:21:42
baby1_9253344: 金币+2 2012-05-11 20:37:24
本帖内容被屏蔽
2楼2012-05-10 13:00:36
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 13:00:36:
你的半胱氨酸是游离的吗？很多蛋白的半胱氨酸都是以二硫键的形式存在。而且你的纯化过程需要加DDT吗？我了解到很多的蛋白质一般没有加DDT保护，即使存在未结合的半胱氨酸。而且，你确信你的产品在镍柱纯化过程中会 ...

文献中蛋白是以游离状态才有活性的。
现在的情况是蛋白在菌体里时是有预期效果的，但是纯化后没有预期效果的，那么蛋白应该还是正确表达了，但是在纯化过程中发生变化了。
设想加DTT等还原剂也是为了排除过程中被氧化的可能性。但是具体怎么操作，不是很了解，所以想请高手解答一下。
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3楼2012-05-10 15:28:48
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王龙辉

禁言 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
telomerase: 应助指数-1, 违规存档, 请不要刷应助指数，谢谢！ 2012-05-10 20:20:35
本帖内容被屏蔽
4楼2012-05-10 16:04:46
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2012-05-10 16:21:45
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★
baby1_9253344: 金币+2 2012-05-11 20:37:44
本帖内容被屏蔽
6楼2012-05-10 16:27:35
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 16:21:45:
你的产品可否在回收以后再加入DDT还原？酸性条件下分离纯化也是被氧化吗？有没有尝试过？

酸性的话小于巯基等电点就可以吗？比如pH6？这个没试过，我是新手。。。蛋白纯化都是头一次做。。。binding buffer和洗脱剂都是pH8的。
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7楼2012-05-10 16:28:39
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-10 16:27:35:
而且始终存在着被氧化的可能性啊。另外，没有活性活性是因为二硫键错配的原因呢？加入巯基乙醇或者DDT，然后通过稀释法复性，测试一下活性怎么样，确定是不是二硫键错配导致的失活。

请问~这个还原剂的浓度大概多大合适呢？就是多大浓度才能起到还原作用呢？太大了的话是不是会不可逆变性啊？

另，
文献中我这类蛋白他们用的是肝素亲和柱纯化的，洗脱剂都是含巯基乙醇的，不晓得是什么tag。我的是his-tag,因为不是生物专业的，所以不想换tag了，太麻烦了。。。
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8楼2012-05-10 16:48:01
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-05-12 11:10:15
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shawne2008

木虫 (著名写手)

木虫反贪局局长

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
baby1_9253344: 金币+2 2012-05-12 18:59:03
加入CGSH看看有没有效果吧，有CGSH的还原力情况下不会形成二硫键
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10楼2012-05-12 17:35:20
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