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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产生非特异性带
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rebornpro

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR产生非特异性带

RT，最近PCR摸索条件，引物单子上写的退火温度是45°（好低啊），这个是45°退火P出来的图，MARKER是DL2000，很奇怪，PCR产物的理论值应该是900多的样子（上面那个不亮的带），结果产物只有500的样子。现在不管产物大小了，就把那个不亮的当非特异性带吧。如何改进PCR条件把这个非特异性带给它去掉。求人解答。
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1楼 2012-05-10 09:34:59
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-10 11:27:57
看你的图片一个是胶制作的不好或者你的电泳仪器不好，把条带都跑歪了。看你的的图改进PCR条件效果应该不佳，因为你的非特异性条带比特异性条带亮的多，说明你引物在另一片段结合的趋势比期望位置更好，所以你提高PCR温度反而致使你的特异性条带没有了，所以建议你另设计引物，你也可以做个反向pcr或者RACE之类的，实验顺利啊
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rebornpro
我努力我奋斗我成功
2楼2012-05-10 09:54:12
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xiaoxiong520

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, good! 2012-05-10 11:27:36
rebornpro: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-10 17:22:28
1、引物的特异性较差。这种情况下，可能会出现很难消除的非特异性扩增；如果模板好的话，多半会有目的片断出现。
2、模板不好。比如，RNA提取得不好，里面有基因组DNA污染或RNA降解比较严重，最终导致cDNA的质量不好。
3、Taq酶出现了问题。保存不当会导致活性改变，从而容易扩出非特异性条带；
若确定引物设计没有问题，以及模板的纯化外，Mg2+浓度过高也会导致非特异性扩增的。还有一个问题就是 可能你的目的基因GC含量比较高，这个可以用软件分析一下，如果GC含量高或者有复杂的二级结构，普通的Taq很难扩增出目的基因。
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rebornpro
3楼2012-05-10 10:17:25
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 辛苦 2012-05-10 11:28:09
楼上的分析已经很好了，我觉得你marker上样量太多了
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4楼2012-05-10 10:30:49
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孙启亮

金虫 (著名写手)
还有，退火温度不要根据单子上的来，你自己还要摸索的。做个温度梯度吧，可能此温度不是你引物与模板结合的最适温度
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5楼2012-05-10 10:32:16
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xiaoyanzi517

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-10 11:28:21
上样量减少点吧。M条带都看不清了。非特异性太强，摸索条件优化，估计也变不了多少了，还是重新设计引物来得快
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偶时晴天偶时雨
6楼2012-05-10 11:12:30
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rebornpro

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaoxiong520 at 2012-05-10 10:17:25:
1、引物的特异性较差。这种情况下，可能会出现很难消除的非特异性扩增；如果模板好的话，多半会有目的片断出现。
2、模板不好。比如，RNA提取得不好，里面有基因组DNA污染或RNA降解比较严重，最终导致cDNA的质量 ...

谢谢回答，我接着摸索条件去。
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7楼2012-05-10 11:13:35
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rebornpro

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-10 10:30:49:
楼上的分析已经很好了，我觉得你marker上样量太多了

我这个marker只点了2uL。。。平时1%的胶点2uL都挺好的，不知道这次怎么这么亮了。
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8楼2012-05-10 11:14:25
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rebornpro

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-05-10 10:32:16:
还有，退火温度不要根据单子上的来，你自己还要摸索的。做个温度梯度吧，可能此温度不是你引物与模板结合的最适温度

温度梯度我做了40°，45°，50°，结果只有45°有结果。我的引物用PP5预测的退火温度有50多°。
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9楼2012-05-10 11:16:12
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rebornpro

铁虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-05-10 09:54:12:
看你的图片一个是胶制作的不好或者你的电泳仪器不好，把条带都跑歪了。看你的的图改进PCR条件效果应该不佳，因为你的非特异性条带比特异性条带亮的多，说明你引物在另一片段结合的趋势比期望位置更好，所以你提高 ...

谢谢回答。
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10楼2012-05-10 11:17:00
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