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rebornpro铁虫 (初入文坛)
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PCR产生非特异性带
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RT，最近PCR摸索条件，引物单子上写的退火温度是45°（好低啊），这个是45°退火P出来的图，MARKER是DL2000，很奇怪，PCR产物的理论值应该是900多的样子（上面那个不亮的带），结果产物只有500的样子。现在不管产物大小了，就把那个不亮的当非特异性带吧。如何改进PCR条件把这个非特异性带给它去掉。求人解答。 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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cheng_xiao
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2楼2012-05-10 09:54:12
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1、引物的特异性较差。这种情况下，可能会出现很难消除的非特异性扩增；如果模板好的话，多半会有目的片断出现。 2、模板不好。比如，RNA提取得不好，里面有基因组DNA污染或RNA降解比较严重，最终导致cDNA的质量不好。 3、Taq酶出现了问题。保存不当会导致活性改变，从而容易扩出非特异性条带； 若确定引物设计没有问题，以及模板的纯化外，Mg2+浓度过高也会导致非特异性扩增的。还有一个问题就是 可能你的目的基因GC含量比较高，这个可以用软件分析一下，如果GC含量高或者有复杂的二级结构，普通的Taq很难扩增出目的基因。 |
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3楼2012-05-10 10:17:25
孙启亮
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