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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达，蛋白活性问题
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applewxy

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【分子生物】EPI帖

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1楼2012-05-08 20:39:12
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sayaya

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-10 13:42:20
首先，反复冻融导致蛋白质失活的可能是存在的。

另外，蛋白质如果有转录后的加工修饰，经原核表达后的蛋白质没有活性是正常的，你得选择真核表达。
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9楼2012-05-10 08:01:47
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hyacinth326

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 13:46:02
蛋白没有活性有可能是表达了包涵体，一般情况下这种反复冻融应该不会失活吧，我们超声裂解有时候条件挺恶劣的也都还好，你可以优化一下表达条件，或者是换别的载体试一下
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2楼2012-05-08 20:52:57
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 专家考核 2012-05-09 13:46:12
如楼上所说，完全没有活性很可能是形成包涵体。
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3楼2012-05-08 22:43:42
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 呵呵，欢迎欢迎，丽美眉又回来了哈 2012-05-09 13:47:20
西瓜: 金币+2, MolEPI+1, 消失了一段时间啊。回答很好，授予EPI！ 2012-05-09 19:02:22
applewxy: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-05-14 22:21:49
出现包涵体很容易被发现也很容易纯化出来，若有包涵体的话你就先变性再复性就是了。Purification of inclusion bodies and refolding of proteins protocol：http://ishare.iask.sina.com.cn/f/18503995.html
但是原核细胞表达的蛋白质失活可不是仅有形成包涵体一种原因。反复冻融可能引起蛋白质的再折叠和冷变性，在一些时候会引起蛋白质的二硫键断裂，虽然二硫键在空气中能够自动氧化，但是蛋白质冷变性后且二硫键断裂开再重新形成可不一定会形成原来天然蛋白质的二硫键，因为原来的细胞内的折叠环境已经不存在了。同样理由，冷变性也不是总是在到室温后就一定复性。检测方法很简单，用红外光谱和紫外光谱同时测定一下你表达的蛋白质与标准品的光谱是否有差异。单独用红外光谱可能会显示二级结构相同让人误以为折叠形态没有改变，实际上可能是拓扑结构发生了改变，即二级结构的种类、数量和彼此位置改变了，这在红外光谱测定的二级结构中显示不出来，单独用紫外光谱可能不是很精确，因为溶液状态，有比较稀，同样折叠的蛋白质折叠态的三级结构可能略有微小差异。
再有考虑，原核生物中的蛋白质没有翻译后修饰，这样也不会形成活性蛋白质。测一下分子量就能检测出来。
另外考虑是否分离时除去了活性辅酶，把它们加回去再测活性。
是否有蛋白质降解和抑制剂。
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4楼2012-05-08 23:08:19
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