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liuxueyan21金虫 (小有名气)
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考马斯亮蓝法测定蛋白过程中的问题
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各位师兄师姐，紧急求助，就是用考马斯亮蓝法测定土壤蛋白，但是不管是预实验还是正式试验，测定的结果并不相同，尽管重复了很多次，不知道问题出哪里了？忘各位师兄师姐帮帮忙。 1、标准曲线时，BSA是需要每次测定都要重新配制吗？在测样品的时候是直接加100ul待测样品，其他与标准曲线一样。 2、提取的土壤蛋白储存在4°冰箱中，放置一个礼拜左右，对测定结果有影响么？还是会有蛋白变性的可能性？还是提取完成后放置在-20°条件？ 3、考马斯染液反应时间为10min，并在一个小时之内测定完成，这个时间是不是有问题？ |
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suruijing
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liuxueyan212楼2012-06-05 19:01:56
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rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-05 22:19:17
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| 4度放置时间长了肯定有问题，这个温度下有一部分蛋白酶还是有活性的。土壤中的其他物质有可能对考染的结果产生影响。 |
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3楼2012-06-05 21:27:06
gywyl1977
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zhang8826857: 金币+1, 欢迎来微生物板块^_^ 2012-06-08 10:27:59
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1) BSA需要一批多配些，分装在棕色瓶中，4度保存。做标准曲线不需要每次都重配，但做好每一瓶做好标准曲线后尽快用掉。启用另一瓶时，如果间隔时间长，需要重新做标准曲线； 2）蛋白提取后肯定要冷冻保存。 3）显色反应一般都在半小时以内。 |
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4楼2012-06-06 00:35:09
protein_
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zhang8826857: 金币+1, 欢迎来微生物板块^_^ 2012-06-08 10:28:10
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| 考马斯亮蓝测定蛋白质的原理是测定蛋白质疏水基团的数量来定蛋白质含量，有一定的误差，随着时间的推移有可能你的样品中的蛋白质可能在分解，样品做出来肯定要冷冻，你可以一次多做点平行，真不行就定氮测定，就是麻烦点，祝好运 |
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5楼2012-06-08 10:23:05
liuxueyan21
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zhang8826857: 金币+1, 欢迎常来微生物板块^_^ 2012-06-12 22:22:35
zhang8826857: 金币+1, 欢迎常来微生物板块^_^ 2012-06-12 22:22:35
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1.我们做标曲用的BSA是冷冻保存的，加样是将样品稀释到标曲范围内后加入50ul。 2.你的蛋白不稳定的话最好也冷冻保存。 3.考马斯染液反应时间为5min，反应5min读数就行。 |
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10楼2012-06-12 13:11:42