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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 考马斯亮蓝法测定蛋白过程中的问题
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liuxueyan21

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2012-06-12 13:11:42
1.我们做标曲用的BSA是冷冻保存的，加样是将样品稀释到标曲范围内后加入50ul。
2.你的蛋白不稳定的话最好也冷冻保存。
3.考马斯染液反应时间为5min，反应5min读数就行。

恩 谢谢。。 我做标曲的BSA是4°保存的。提取的蛋白也是4°保存。只是考马斯染液反应时间我设置的是10min，下次改换5min试试。不过，你说的将样品稀释到标曲范围后再加入50ul是什么意思啊？？我一般就是提取土壤里面的蛋白以后，直接加100ul，并没有对其进行稀释。。
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11楼2012-06-12 14:59:37
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kedaxiaoyu

木虫 (职业作家)

神虫浮云

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
liuxueyan21: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-06-12 17:17:16
蛋白的浓度测定需要在标曲的范围内，超过范围后测定的数值误差大的就失去参考价值了。加50ul和加100ul其实是一样的，浓度不在标曲范围内需要稀释后再取100ul测定会准确些。
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liuxueyan21
12楼2012-06-12 15:08:00
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liuxueyan21

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by kedaxiaoyu at 2012-06-12 15:08:00
蛋白的浓度测定需要在标曲的范围内，超过范围后测定的数值误差大的就失去参考价值了。加50ul和加100ul其实是一样的，浓度不在标曲范围内需要稀释后再取100ul测定会准确些。

好的 谢谢哈。。下次试试看。。
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13楼2012-06-12 17:18:06
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zfhist

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liuxueyan21 at 2012-06-12 09:16:00
你说的冷冻保存是什么条件下保存啊？？-20°么？？...

-4即可，保存七天左右没问题。
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liuxueyan21 liuxueyan21
认认真真做人，踏踏实实做事！
14楼2012-06-12 20:28:11
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liuxueyan21

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by zfhist at 2012-06-12 20:28:11
-4即可，保存七天左右没问题。...

恩 好的 谢谢哈！
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15楼2012-06-12 21:45:09
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liuxueyan21

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by zfhist at 2012-06-12 20:28:11
-4即可，保存七天左右没问题。...

恩 好的 谢谢哈！
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16楼2012-06-12 21:46:21
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chengjg
引用回帖:
5楼: Originally posted by protein_ at 2012-06-08 10:23:05
考马斯亮蓝测定蛋白质的原理是测定蛋白质疏水基团的数量来定蛋白质含量，有一定的误差，随着时间的推移有可能你的样品中的蛋白质可能在分解，样品做出来肯定要冷冻，你可以一次多做点平行，真不行就定氮测定，就是麻 ...

17楼2012-06-12 23:44:39
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lihao1988903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

标准曲线一般重新做比较准确。我们取样总体积是250ul不知道你们的是不是。而且要稀释一定倍数然后再反应5分钟等连续几次读数稳定后，让读数在0.2-0.8之间，记录吸光度值，再用公式计算下。
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liuxueyan21
18楼2012-06-13 16:02:15
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liuxueyan21

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
18楼: Originally posted by lihao1988903 at 2012-06-13 16:02:15
标准曲线一般重新做比较准确。我们取样总体积是250ul不知道你们的是不是。而且要稀释一定倍数然后再反应5分钟等连续几次读数稳定后，让读数在0.2-0.8之间，记录吸光度值，再用公式计算下。

我们这我是第一个做这东西，都是自己在摸索。我从来没有稀释过，你说的连续几次读数稳定是什么意思啊？？
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19楼2012-06-13 16:15:03
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zfhist

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by liuxueyan21 at 2012-06-12 09:14:41
我4°放置的时间也不长，最多的也就四五天，最悲催的是，我有一次提取完成了以后，第二天测定的，结果全是负值。。...

一方面可以检查是不是机器故障，如基线没有归零；
另一方面样品总量是不是足够；一般鲜重以0.5g为宜。
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liuxueyan21
认认真真做人，踏踏实实做事！
20楼2012-06-14 19:02:18
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