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liuxueyan21金虫 (小有名气)
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[求助]
考马斯亮蓝法测定蛋白过程中的问题
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各位师兄师姐，紧急求助，就是用考马斯亮蓝法测定土壤蛋白，但是不管是预实验还是正式试验，测定的结果并不相同，尽管重复了很多次，不知道问题出哪里了？忘各位师兄师姐帮帮忙。 1、标准曲线时，BSA是需要每次测定都要重新配制吗？在测样品的时候是直接加100ul待测样品，其他与标准曲线一样。 2、提取的土壤蛋白储存在4°冰箱中，放置一个礼拜左右，对测定结果有影响么？还是会有蛋白变性的可能性？还是提取完成后放置在-20°条件？ 3、考马斯染液反应时间为10min，并在一个小时之内测定完成，这个时间是不是有问题？ |
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lihao1988903
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【答案】应助回帖
| 标准曲线一般重新做比较准确。我们取样总体积是250ul不知道你们的是不是。而且要稀释一定倍数然后再反应5分钟等连续几次读数稳定后，让读数在0.2-0.8之间，记录吸光度值，再用公式计算下。 |
liuxueyan2118楼2012-06-13 16:02:15
suruijing
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2楼2012-06-05 19:01:56
【答案】应助回帖
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rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-05 22:19:17
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-05 22:19:17
| 4度放置时间长了肯定有问题，这个温度下有一部分蛋白酶还是有活性的。土壤中的其他物质有可能对考染的结果产生影响。 |
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3楼2012-06-05 21:27:06
gywyl1977
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【答案】应助回帖
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zhang8826857: 金币+1, 欢迎来微生物板块^_^ 2012-06-08 10:27:59
zhang8826857: 金币+1, 欢迎来微生物板块^_^ 2012-06-08 10:27:59
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1) BSA需要一批多配些，分装在棕色瓶中，4度保存。做标准曲线不需要每次都重配，但做好每一瓶做好标准曲线后尽快用掉。启用另一瓶时，如果间隔时间长，需要重新做标准曲线； 2）蛋白提取后肯定要冷冻保存。 3）显色反应一般都在半小时以内。 |
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4楼2012-06-06 00:35:09
