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saliangqh

新虫 (正式写手)

[交流] DNA电泳

跑DNA电泳的亲们 交流一下DNA电泳吧 谢谢了


这是我跑的电泳
用CTAB法提取
将样品加20μl SDS和1ml预热的CTAB提取液，在65℃下水浴1h，其每间隔5min轻轻摇晃，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1，在漩涡混合器上震荡混匀，10000r4℃离心10min，取上清加1ml冷冻的无水乙醇和50μl乙酸钠（3M PH=5）-20℃冷冻1h，10000r4℃离心10min，用70%无水乙醇洗涤2次，干燥后加TE溶解，-20℃保存备用。
0.8%琼脂糖电泳 染色10min 凝胶成像
出来的图像是这样的 想请大家帮分析一下 谢谢

[ Last edited by saliangqh on 2012-5-2 at 17:11 ]
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1楼2012-05-01 21:07:56
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回帖置顶 ( 共有1个 )

saliangqh

新虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-08 18:55:50
引用回帖:
2楼: Originally posted by muc_huanliu at 2012-05-01 22:37:51:
呵呵，楼主想问什么呢？电泳这个词汇太单一了，建议说具体问题。

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带
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10楼2012-05-02 17:13:14
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 13:38:44
胶配的不怎么样，marker跑成那样。
描述的提取步骤太模糊了，什么样品、裂解液浓度、操作动作、上清体积、加乙醇体积、电泳条件等等都没说清楚。
如果是基因组DNA，建议使用lambdaDNA/HindIII maker。
如果是提基因组DNA，提的不怎么样：有些没提出来，有些降解，有些有很严重的RNA污染。
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22楼2012-05-03 08:52:22
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后悔无期

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-07 13:39:01
我了解楼主是什么意思，楼上有几位没看明白，楼主跑的琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带。条带不清晰，不太亮，marker好像跑的也不太好！PCR 能不能P的出来存在的情况有很多种，任何一个环节都有可能，任何一个小的动作，都可能导致实验结果不理想或者失败。从源头把关。。。
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27楼2012-05-06 22:24:48
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 后悔无期 at 2012-05-06 22:24:48:
我了解楼主是什么意思，楼上有几位没看明白，楼主跑的琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带。条带不清晰，不太亮，marker好像跑的也不太好！PCR 能不能P的出来存在的情况有很多种，任何一个环节都有可能，任何一个小的动作， ...

恩 好的 谢谢 可否问一下楼主用什么提取藻类中的DNA效果好啊
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28楼2012-05-07 20:27:36
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普通回帖

muc_huanliu

金虫 (正式写手)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
呵呵，楼主想问什么呢？电泳这个词汇太单一了，建议说具体问题。
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2楼2012-05-01 22:37:51
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杜保群

金虫 (小有名气)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
是啊  太笼统了   还是具体一些好
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3楼2012-05-01 23:36:13
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308630949

银虫 (小有名气)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
你想交流什么？我觉得还好吧，没什么困难的...
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4楼2012-05-02 09:47:58
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可帅儿

银虫 (正式写手)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
要说什么呢？
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5楼2012-05-02 09:54:55
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
没明白意图楼主，请说明你的具体交流项目
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6楼2012-05-02 11:14:46
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elon_ma

禁言 (初入文坛)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
7楼2012-05-02 14:33:59
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超然渡陈

金虫 (小有名气)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
你就只说一个交流电泳，宽的没边没际了……
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8楼2012-05-02 15:12:59
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 杜保群 at 2012-05-01 23:36:13:
是啊  太笼统了   还是具体一些好

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带
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11楼2012-05-02 17:13:21
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 308630949 at 2012-05-02 09:47:58:
你想交流什么？我觉得还好吧，没什么困难的...

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带
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12楼2012-05-02 17:13:31
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 可帅儿 at 2012-05-02 09:54:55:
要说什么呢？

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带
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13楼2012-05-02 17:13:37
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chenguestc at 2012-05-02 11:14:46:
没明白意图楼主，请说明你的具体交流项目

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带
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14楼2012-05-02 17:13:53
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2012-05-02 15:12:59:
你就只说一个交流电泳，宽的没边没际了……

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带
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15楼2012-05-02 17:14:03
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saliangqh

新虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhixuec at 2012-05-02 16:56:39:

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带
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16楼2012-05-02 17:14:17
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 308630949 at 2012-05-02 09:47:58:
你想交流什么？我觉得还好吧，没什么困难的...

谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 我这是提的藻类中的DNA 如何改进可跑出更好的带
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17楼2012-05-02 17:15:50
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summerjane

铁虫 (小有名气)
★ ★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-08 18:56:07
请问楼主你提取的是不是基因组DNA？
如果是基因组DNA琼脂糖电泳的结果就是这种模糊的（smear），没有清晰的条带
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19楼2012-05-02 20:11:05
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by summerjane at 2012-05-02 20:11:05:
请问楼主你提取的是不是基因组DNA？
如果是基因组DNA琼脂糖电泳的结果就是这种模糊的（smear），没有清晰的条带

是呢 不过我这个还有没有能跑出的稍微好点 这样也太不清晰了
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20楼2012-05-02 20:40:11
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tttyyjj

铁杆木虫 (正式写手)
★
saliangqh(金币+1): 谢谢参与
是全基因组条带吧，这样也算正常的。
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21楼2012-05-03 07:26:16
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by longrna at 2012-05-03 08:52:22:
胶配的不怎么样，marker跑成那样。
描述的提取步骤太模糊了，什么样品、裂解液浓度、操作动作、上清体积、加乙醇体积、电泳条件等等都没说清楚。
如果是基因组DNA，建议使用lambdaDNA/HindIII maker。
如果是提 ...

谢谢 呵呵 我提的是发菜中的DNA  我用的CTAB法 你可否给我一个准确好的提取方法 我没有加蛋白酶和RNA酶
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23楼2012-05-03 17:27:26
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姜传军

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你提的DNA有太多的断裂片段
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24楼2012-05-04 11:03:01
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-08 18:56:39
引用回帖:
10楼: Originally posted by saliangqh at 2012-05-02 17:13:14:
谢谢了 我想请您帮忙分析一下我的电泳为什么跑出来的带这样 如何改进可跑出更好的带

我觉得这应该不是电泳的问题，而是你提取的DNA的问题！
若果是电泳问题，MAKER应该也会呈现拖尾现象。但是MAKER跑的还不错，所以可能是你提取的DNA有问题！   楼主是提取质粒还是普通DNA？
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25楼2012-05-04 12:48:49
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-05-04 12:48:49:
我觉得这应该不是电泳的问题，而是你提取的DNA的问题！
若果是电泳问题，MAKER应该也会呈现拖尾现象。但是MAKER跑的还不错，所以可能是你提取的DNA有问题！   楼主是提取质粒还是普通DNA？

是普通的DNA
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26楼2012-05-06 18:17:56
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longrna

新虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+3, Good！杀生丸同学很热心~ 2012-05-08 18:57:04
样品应该能用液氮研磨吧？研磨充分一点，然后缩短一点水浴时间（降解降解的的可能性），水浴20-30min。
加入酚氯仿后不要用涡旋仪，改用手轻柔颠倒20-30min混匀（对提取完整性好的gDNA有所帮助。）
在上清前加入RNase A，消化掉RNA，排除弥散是由于降解的RNA引起。

祝实验顺利。
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29楼2012-05-08 14:46:17
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
29楼: Originally posted by longrna at 2012-05-08 14:46:17:
样品应该能用液氮研磨吧？研磨充分一点，然后缩短一点水浴时间（降解降解的的可能性），水浴20-30min。
加入酚氯仿后不要用涡旋仪，改用手轻柔颠倒20-30min混匀（对提取完整性好的gDNA有所帮助。）
在上清前加入 ...

谢谢 我再试试做做 看看效果如何
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30楼2012-05-08 19:13:08
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uneei

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-09 14:02:53
前面的说的很对，就是RNA污染加上DNA片段降解加打断了，看你的点样孔还很亮，估计还有蛋白多糖之类的污染，混匀什么的步骤你动作轻柔一点，我以前也这样过，不过后来换了试剂盒提就没这种问题了。在23KB处非常清晰，弥散很少。不过我提的是细菌的基因组DNA，如果楼主的老师经费充足的话，建议用试剂盒。。。效果好很多，对后续的一系列的实验都有决定性的帮助。
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31楼2012-05-09 13:00:52
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saliangqh

新虫 (正式写手)
引用回帖:
31楼: Originally posted by uneei at 2012-05-09 13:00:52:
前面的说的很对，就是RNA污染加上DNA片段降解加打断了，看你的点样孔还很亮，估计还有蛋白多糖之类的污染，混匀什么的步骤你动作轻柔一点，我以前也这样过，不过后来换了试剂盒提就没这种问题了。在23KB处非常清晰 ...

恩 谢谢了 楼主 我们还没有药品
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32楼2012-05-09 14:36:36
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xiaoxiong520

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西瓜: 金币+4, 鼓励交流 2012-05-09 18:52:31
（1）  操作上：磨样后加入裂解液可以用漩涡混合器上震荡混匀，之后抽提过程中不可剧烈震荡，否则DNA容易断裂；
（2） 电泳结果：
     点样孔很亮的，说明提取的DNA含蛋白质等杂质；
      靠近点样孔附近的稍亮的带是DNA，下部较亮的是RNA，且降解厉害，建议提完DNA后，用1%的RNase于37℃消化RNA 2h；
     检测DNA时，注意琼脂糖凝胶厚度不要超过0.5cm，否则影响成像效果，电压要稳，缓冲液尽量用新配的；
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33楼2012-05-09 17:10:45
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ZOEY21

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
从左到右应该说6、7、8看到点样孔发亮，有蛋白残留。
1、2还是可以的。7、8也看得到单一亮带。（这点想跟大家交流下，有人说基因组DNA电泳就应该是这种弥散状的，也有人说应该是单一无拖尾的细条带，哪种对呐）
所有样品都弥散了，操作过程动作太剧烈，DNA打碎了。
水浴1h没有问题。（这个时间以前我们这么干过）
RNA觉得跑电泳不好看就加RNA酶，不去一般不影响后续的PCR。
这种程度的DNA要求不严的PCR可以出结果。（3、4就不敢说了）
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34楼2012-05-09 19:57:21
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bioleo

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
三个建议：RANase，Proteinase，全程低温。
PS：提基因组不用迷信试剂盒，试剂盒提质粒和小片段推荐。
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35楼2012-08-24 10:07:32
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zhixuec9楼
2012-05-02 16:56   回复  
saliangqh(金币+1): 谢谢参与[rate]saliangqh 2 16[/rate]
zhixuec18楼
2012-05-02 17:21   回复  
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