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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求各位大神交流感受态制作心得
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

[交流] 求各位大神交流感受态制作心得

最近用TSS法做的大肠杆菌感受态一直不好，很好奇传说中的10的八次方的效率是如何做出来的，特请各位大神交流一下经验，当然不仅限于TSS法~~~
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1楼 2012-04-24 16:09:36
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phoenix.ren

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
liuyu_sdili: 金币+1, 谢谢帮助！！ 2012-04-24 17:51:14
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-24 18:39:23
照着分子生物学的书上CaCl2法做就行了。主要是操作的时候注意低温，一般都没有问题的。
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2楼2012-04-24 16:35:32
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to-be

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
liuyu_sdili: 金币+4, 很有帮助 2012-04-24 20:09:27
amisking: MolEPI+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-04-24 20:16:18
我们经验是；
1.开始摇菌不要过了，宁可获得的菌体少，也不要太浓了。
2.停止生长要迅速，在冰上越快越好。
3.中间系的过程中一定要防止污染，防止冰滴或溅入菌体中。
4.做好要迅速液氮冷冻，-80度保存。
5.快速使用（2-3个月内），自己做的感受态放置过久效果很不好。
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3楼2012-04-24 19:29:25
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rhguo

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没有自己做过，不过好像用试剂盒会快很多
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4楼2012-04-25 19:47:10
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
liuyu_sdili: 金币+1, 谢谢 交流经验 2012-04-26 08:57:12
就是按照说明书，低温，还有就是CaCl2，别的没什么，很简单
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5楼2012-04-25 21:21:53
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ixido

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
liuyu_sdili: 金币+2, 谢谢交流 2012-04-27 10:55:24
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-27 13:43:33
有一个传说中的hanaha法，可以做到很高，但是实验室里没有人成功实践出来。楼主只要按照分子克隆指南上的指导认真做就可以了，一般转化，甚至共转两个质粒都没有问题。
保持整个过程的低温是最重要的。
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6楼2012-04-27 10:24:28
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guozhixia121

铁虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
liuyu_sdili: 金币+1, 谢谢交流 2012-05-01 22:34:08
氯化钙法（Calcium Chloride）

本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5 x 106 到 2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA
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7楼2012-05-01 20:55:25
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vir2008

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
liuyu_sdili: 金币+1, 谢谢交流 2012-05-02 19:57:01
氯化钙法一般可以满足要求了。
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8楼2012-05-02 19:00:52
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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liuyu_sdili: 金币+5, 很好很有帮助 2012-05-03 08:55:36
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-03 13:38:36
我做过一般氯化钙和Inoue法，经验就是
1.氯化钙和Inoue要过滤灭菌，期间烧杯、容量瓶、勺子、注射器、量筒、纯水都要灭菌干燥后使用。保证什么都是干净的。
2.菌不能摇过了，大约0.3-0.5就可以了
3.我都是先分装菌，然后在做感受态的
4.在超净台工作，如果那段时间大家在做其他的基因克隆，做过连接和转化的话，我会选个另外的时间做。
5.氯化钙法，我都是当天摇菌当天做，Inoue法，都是过夜低温摇
6做好感受态，要在无抗和有抗的固体培养基上培养，以保证感受态没有被污染
7.感受态最好在三个月内用完
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9楼2012-05-03 08:40:20
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小五来了

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我是做的电转的大肠感受态，一般是10的9次方吧，好一点能达到10的10次方，关键就是接种过夜的菌后，大概养一个半小时，然后冰浴，转速不能太大，在用水和甘油洗的时候不能用力过猛，要轻轻的晃离心管，一点一点的用水刮下来，还有整个过程要保持低温，
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10楼2013-05-29 14:05:49
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