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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot实验技术
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

[求助] western blot实验技术

刚开始煮蛋白会起泡泡,溢出正常么？还有我的目的蛋白是75KD我250mA的电流转膜一个半小时可以将目的蛋白转过去么？显影的时候我的内参条带很好，但是目的蛋白没有，是什么原因？
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1楼 2012-04-14 13:38:55
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sxwsp

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-12 15:28:36
内参45左右，而你的蛋白75，应该不是转膜的问题。一个班小时足够了。目的蛋白没有显影的最大可能就是抗体，抗体不行或者孵抗条件不对
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2楼2012-04-22 13:56:45
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-12 15:28:52
煮样冒泡正常啊，用封口膜封好就行了。另外想知道转膜有没有问题直接点个预染marker，看看预染marker转的效果不就知道了。
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sunxiao1987
scienceguy
3楼2012-04-22 22:57:47
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by hellolin at 2012-04-22 22:57:47:
煮样冒泡正常啊，用封口膜封好就行了。另外想知道转膜有没有问题直接点个预染marker，看看预染marker转的效果不就知道了。

先谢谢啦，我用了预染marker,marker 都转过去了的。现在，目的条带有显出来，但是很淡，而且背景很高，今天延长了封闭时间和降低了二抗浓度，背景市有所降低，但是目的条带变的更淡了，不知道是不是二抗的特异性不好呢？
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4楼2012-05-10 23:20:39
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sunxiao1987 at 2012-05-10 23:20:39:
先谢谢啦，我用了预染marker,marker 都转过去了的。现在，目的条带有显出来，但是很淡，而且背景很高，今天延长了封闭时间和降低了二抗浓度，背景市有所降低，但是目的条带变的更淡了，不知道是不是二抗的特异性 ...

条带淡的话加大上样量就是咯，可能样品里你的蛋白就少呢，或者加一抗也可以~
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scienceguy
5楼2012-05-11 10:37:13
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hellolin at 2012-05-11 10:37:13:
条带淡的话加大上样量就是咯，可能样品里你的蛋白就少呢，或者加一抗也可以~

我的蛋白是不多，现在上样量已经很高了，在增加上样量的话背景会更深，我的一抗是多克隆的，增加抗体的浓度会有很多非特异条带。
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6楼2012-05-11 22:24:15
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叶倾意

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-16 08:17:03
[1]你的电压是多少？
按照你的稳流转膜条件，绝对可以的，我的条带是150KD，一个小时都可以搞定。。。
[2]目的条带没有，而内参有，有很多原因，首先你看看是不是免疫印迹步骤的问题啊？然后就是你的“目的条带”其实不是你的目的条带，要是你都确定了，为啥还要做WB再确定呢？
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自知者智 自胜者勇 自暴者弃 自强者成
7楼2012-05-15 20:02:56
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一抗还是避免多克隆的吧。实在不行用封闭液稀释一抗，会减少杂带的。
还是不行就换个单克隆的一抗
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8楼2012-05-16 10:12:03
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sjn0301

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

sunxiao1987: 回帖置顶 2012-05-16 13:25:57
看来你的内参和目的条带用的是同一种一抗，这样的话内参和目的带可能会竞争一抗，而结果是一抗在内参位置上富集，使得目的条带较弱，我想你可以按照预染marker的位置将膜从45kd和75kd之间裁开，分别加一抗孵育试试效果。
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9楼2012-05-16 11:01:13
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sjn0301 at 2012-05-16 11:01:13:
看来你的内参和目的条带用的是同一种一抗，这样的话内参和目的带可能会竞争一抗，而结果是一抗在内参位置上富集，使得目的条带较弱，我想你可以按照预染marker的位置将膜从45kd和75kd之间裁开，分别加一抗孵育试试 ...

我是将胶裁开，分别孵育一抗的。现在显影，内参是很多相似的条带在一起，像重影，一层层的，是不是我的样品降解了？还是在胶里扩散了啊？还是求解啊！
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10楼2012-05-16 13:25:30
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