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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

[求助] western blot实验技术

刚开始煮蛋白会起泡泡,溢出正常么?还有我的目的蛋白是75KD我250mA的电流转膜一个半小时可以将目的蛋白转过去么?显影的时候我的内参条带很好,但是目的蛋白没有,是什么原因?
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sxwsp

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-12 15:28:36
内参45左右,而你的蛋白75,应该不是转膜的问题。一个班小时足够了。目的蛋白没有显影的最大可能就是抗体,抗体不行或者孵抗条件不对
2楼2012-04-22 13:56:45
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-12 15:28:52
煮样冒泡正常啊,用封口膜封好就行了。另外想知道转膜有没有问题直接点个预染marker,看看预染marker转的效果不就知道了。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

scienceguy
3楼2012-04-22 22:57:47
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by hellolin at 2012-04-22 22:57:47:
煮样冒泡正常啊,用封口膜封好就行了。另外想知道转膜有没有问题直接点个预染marker,看看预染marker转的效果不就知道了。

先谢谢啦,我用了预染marker,marker 都转过去了的。现在,目的条带有显出来,但是很淡,而且背景很高,今天延长了封闭时间和降低了二抗浓度,背景市有所降低,但是目的条带变的更淡了,不知道是不是二抗的特异性不好呢?
4楼2012-05-10 23:20:39
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by sunxiao1987 at 2012-05-10 23:20:39:
先谢谢啦,我用了预染marker,marker 都转过去了的。现在,目的条带有显出来,但是很淡,而且背景很高,今天延长了封闭时间和降低了二抗浓度,背景市有所降低,但是目的条带变的更淡了,不知道是不是二抗的特异性 ...

条带淡的话加大上样量就是咯,可能样品里你的蛋白就少呢,或者加一抗也可以~
scienceguy
5楼2012-05-11 10:37:13
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hellolin at 2012-05-11 10:37:13:
条带淡的话加大上样量就是咯,可能样品里你的蛋白就少呢,或者加一抗也可以~

我的蛋白是不多,现在上样量已经很高了,在增加上样量的话背景会更深,我的一抗是多克隆的,增加抗体的浓度会有很多非特异条带。
6楼2012-05-11 22:24:15
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叶倾意

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-16 08:17:03
[1]你的电压是多少?
按照你的稳流转膜条件,绝对可以的,我的条带是150KD,一个小时都可以搞定。。。
[2]目的条带没有,而内参有,有很多原因,首先你看看是不是免疫印迹步骤的问题啊?然后就是你的“目的条带”其实不是你的目的条带,要是你都确定了,为啥还要做WB再确定呢?
自知者智 自胜者勇 自暴者弃 自强者成
7楼2012-05-15 20:02:56
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一抗还是避免多克隆的吧。实在不行用封闭液稀释一抗,会减少杂带的。
还是不行就换个单克隆的一抗
8楼2012-05-16 10:12:03
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sjn0301

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

sunxiao1987: 回帖置顶 2012-05-16 13:25:57
看来你的内参和目的条带用的是同一种一抗,这样的话内参和目的带可能会竞争一抗,而结果是一抗在内参位置上富集,使得目的条带较弱,我想你可以按照预染marker的位置将膜从45kd和75kd之间裁开,分别加一抗孵育试试效果。
9楼2012-05-16 11:01:13
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by sjn0301 at 2012-05-16 11:01:13:
看来你的内参和目的条带用的是同一种一抗,这样的话内参和目的带可能会竞争一抗,而结果是一抗在内参位置上富集,使得目的条带较弱,我想你可以按照预染marker的位置将膜从45kd和75kd之间裁开,分别加一抗孵育试试 ...

我是将胶裁开,分别孵育一抗的。现在显影,内参是很多相似的条带在一起,像重影,一层层的,是不是我的样品降解了?还是在胶里扩散了啊?还是求解啊!
10楼2012-05-16 13:25:30
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