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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

[求助] western blot实验技术

刚开始煮蛋白会起泡泡,溢出正常么？还有我的目的蛋白是75KD我250mA的电流转膜一个半小时可以将目的蛋白转过去么？显影的时候我的内参条带很好，但是目的蛋白没有，是什么原因？
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1楼2012-04-14 13:38:55
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
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3楼: Originally posted by hellolin at 2012-04-22 22:57:47:
煮样冒泡正常啊，用封口膜封好就行了。另外想知道转膜有没有问题直接点个预染marker，看看预染marker转的效果不就知道了。

先谢谢啦，我用了预染marker,marker 都转过去了的。现在，目的条带有显出来，但是很淡，而且背景很高，今天延长了封闭时间和降低了二抗浓度，背景市有所降低，但是目的条带变的更淡了，不知道是不是二抗的特异性不好呢？
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4楼2012-05-10 23:20:39
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by hellolin at 2012-05-11 10:37:13:
条带淡的话加大上样量就是咯，可能样品里你的蛋白就少呢，或者加一抗也可以~

我的蛋白是不多，现在上样量已经很高了，在增加上样量的话背景会更深，我的一抗是多克隆的，增加抗体的浓度会有很多非特异条带。
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6楼2012-05-11 22:24:15
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by sjn0301 at 2012-05-16 11:01:13:
看来你的内参和目的条带用的是同一种一抗，这样的话内参和目的带可能会竞争一抗，而结果是一抗在内参位置上富集，使得目的条带较弱，我想你可以按照预染marker的位置将膜从45kd和75kd之间裁开，分别加一抗孵育试试 ...

我是将胶裁开，分别孵育一抗的。现在显影，内参是很多相似的条带在一起，像重影，一层层的，是不是我的样品降解了？还是在胶里扩散了啊？还是求解啊！
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10楼2012-05-16 13:25:30
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by flownaway at 2012-05-19 23:05:09:
有没有可能是抗体失效，稀释得太稀，或者蛋白的表达量不够？显影液使用太久效果也会变差

我的抗体是三月底刚买的。稀释是1:200的，推荐的稀释比例是1:200-1:1000，显影液的话我是用两次就换新的了。我的蛋白表达丰度没有具体报道，但是文献上上样20ug就可以做出来了，我上样好几百ug才只有很淡的条带，会不会是一抗的特异性很低啊？
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13楼2012-05-20 10:04:12
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