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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

[求助] western blot实验技术

刚开始煮蛋白会起泡泡,溢出正常么?还有我的目的蛋白是75KD我250mA的电流转膜一个半小时可以将目的蛋白转过去么?显影的时候我的内参条带很好,但是目的蛋白没有,是什么原因?
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by flownaway at 2012-05-19 23:05:09:
有没有可能是抗体失效,稀释得太稀,或者蛋白的表达量不够?显影液使用太久效果也会变差

我的抗体是三月底刚买的。稀释是1:200的,推荐的稀释比例是1:200-1:1000,显影液的话我是用两次就换新的了。我的蛋白表达丰度没有具体报道,但是文献上上样20ug就可以做出来了,我上样好几百ug才只有很淡的条带,会不会是一抗的特异性很低啊?
13楼2012-05-20 10:04:12
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sxwsp

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-12 15:28:36
内参45左右,而你的蛋白75,应该不是转膜的问题。一个班小时足够了。目的蛋白没有显影的最大可能就是抗体,抗体不行或者孵抗条件不对
2楼2012-04-22 13:56:45
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-12 15:28:52
煮样冒泡正常啊,用封口膜封好就行了。另外想知道转膜有没有问题直接点个预染marker,看看预染marker转的效果不就知道了。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

scienceguy
3楼2012-04-22 22:57:47
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sunxiao1987

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by hellolin at 2012-04-22 22:57:47:
煮样冒泡正常啊,用封口膜封好就行了。另外想知道转膜有没有问题直接点个预染marker,看看预染marker转的效果不就知道了。

先谢谢啦,我用了预染marker,marker 都转过去了的。现在,目的条带有显出来,但是很淡,而且背景很高,今天延长了封闭时间和降低了二抗浓度,背景市有所降低,但是目的条带变的更淡了,不知道是不是二抗的特异性不好呢?
4楼2012-05-10 23:20:39
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