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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里
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zh10008100

铁虫 (初入文坛)

[求助] 载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里

我用的是Petduet的载体，选用的是bamHI和Xhol的酶切位点，载体双酶切过，用以前的酶切产物链接并做了菌液PCR-MIx鉴定，是连上的，说明载体是挺好用的。

我需要连接一个1500bp的目的片段，也是B/X的酶切位点，可是试了很多次，菌液PCR几乎都没有阳性的克隆。平板上长的克隆也比较少，一般就三四个。

酶切体系40ul

PCR产物 20ul
10 X H    4ul
BamhI    1.5ul
XholI       1.5ul
ddH2O    13ul

酶切6~8小时，连接体系8ul，按照TAKARA 的 Solution I 说明书来连。
1个月了，还是没有构建成功。求助！很着急！

PetDuet-1
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1楼 2012-04-13 18:34:54
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diy患者

铁虫 (正式写手)
从最容易的开始。
1.检查感受态的效率，对于双酶切再连接，我的建议是至少要10的7次方才行。如果自己做不好，，买成品，效率很高，大概能到8次方。

2.检查载体的酶切效果，分别酶切，看切割效率。然后割胶回收。

3.检查目的基因：这个不好检查酶切效率，建议先连T载体，然后再分别看两种酶的效率。再割胶回收。比较麻烦。

个人认为如果第一条能做好就有80%以上的把握连上。
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7楼2012-04-15 21:29:54
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-13 20:09:29
zh10008100: 金币+3, 设计，保护碱基什么都有的，但是由于条件限制没有办法来估计PCR产物的量 2012-04-14 12:44:11
总是连不上，因为酶切连接涉及的过程比较多，从LZ的表述来看：
1）首先确认载体酶切没有问题。你说以前有连上好用，但建议从新酶切质粒载体回收待用。
2）其次确认连接的目的片段酶切没有问题。设计引物时有没有加保护碱基？确认内切酶没有错误？PCR产物有没有纯化？建议将PCR产物纯化回收，定量后再进行酶切1-5ugDNA，然后再过柱纯化回收用于后面的连接。
3）再次，确认连接体系没有问题。连接前准确定量酶切好的载体和目的片段的浓度，根据浓度配制连接体系连接，有些人很喜欢用多少ul来定量，这是非常不准确的。
4）确认感受态没有问题。
如果以上问题都解决了，一般两天就会出结果。载体pETDuet大小5.4k和目的片段1.5k应该是很好连的，祝实验顺利！
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2楼2012-04-13 19:35:47
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zh10008100: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-04-14 12:43:26
其实TAKARA 的 Solution I我之前用过，连接效果不是很好，你换一下Frementas的快速连接试剂盒试试吧，而且对于载体你如果只切掉几十个碱基的话可以考虑用乙醇沉淀法回收载体，那样连接效果比较好，记得加四分之一的醋酸钠。还有连接时载体一定要少，可以多加点目的片段。我的15186bp都已经连接到载体上了，相信你也没问题。还有非常同意楼上说的目的片段pcr之前要加入保护碱基。加油啊
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2012-04-13 21:48:14
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zh10008100: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-04-14 12:43:17
首先，你的PCR产物的浓度是多少？一般，你的PCR产物大小为1500bp，酶切时总量有0.5ug就足够了。我估计你的20ulPCR的总量会远多于0.5ug，建议你在设计酶切反应前，对你的DNA样品进行定量。
另外，即使你酶切0.5ug，完全酶切你的PCR产物所需的XhoI为32U，所需的BamHI为大约6U。看来你的设计中XhoI加的量不太够，导致你的XhoI酶切不完全，因而克隆效率低。
而且建议你用BufferK可能更好些。
请注意：在切同一种DNA分子时，即使都是单切点，不同的酶所需的酶量也通常是不同。而且由于PCR产物通常比载体分子小很多（假定PCR的大小是载体的1/n），这时，完全酶切相同量的PCR产物比酶切载体所需的酶量要多n倍。
希望对你设计酶切有帮助。
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4楼2012-04-13 23:17:29
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