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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里
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zh10008100

铁虫 (初入文坛)

[求助] 载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里

我用的是Petduet的载体，选用的是bamHI和Xhol的酶切位点，载体双酶切过，用以前的酶切产物链接并做了菌液PCR-MIx鉴定，是连上的，说明载体是挺好用的。

我需要连接一个1500bp的目的片段，也是B/X的酶切位点，可是试了很多次，菌液PCR几乎都没有阳性的克隆。平板上长的克隆也比较少，一般就三四个。

酶切体系40ul

PCR产物 20ul
10 X H    4ul
BamhI    1.5ul
XholI       1.5ul
ddH2O    13ul

酶切6~8小时，连接体系8ul，按照TAKARA 的 Solution I 说明书来连。
1个月了，还是没有构建成功。求助！很着急！

PetDuet-1
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1楼 2012-04-13 18:34:54
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

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zh10008100: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-04-14 12:43:26
其实TAKARA 的 Solution I我之前用过，连接效果不是很好，你换一下Frementas的快速连接试剂盒试试吧，而且对于载体你如果只切掉几十个碱基的话可以考虑用乙醇沉淀法回收载体，那样连接效果比较好，记得加四分之一的醋酸钠。还有连接时载体一定要少，可以多加点目的片段。我的15186bp都已经连接到载体上了，相信你也没问题。还有非常同意楼上说的目的片段pcr之前要加入保护碱基。加油啊
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
3楼2012-04-13 21:48:14
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