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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体总是连不上，已经一个月了~真心求助，详细在帖子里
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srlee

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-13 20:09:29
zh10008100: 金币+3, 设计，保护碱基什么都有的，但是由于条件限制没有办法来估计PCR产物的量 2012-04-14 12:44:11
总是连不上，因为酶切连接涉及的过程比较多，从LZ的表述来看：
1）首先确认载体酶切没有问题。你说以前有连上好用，但建议从新酶切质粒载体回收待用。
2）其次确认连接的目的片段酶切没有问题。设计引物时有没有加保护碱基？确认内切酶没有错误？PCR产物有没有纯化？建议将PCR产物纯化回收，定量后再进行酶切1-5ugDNA，然后再过柱纯化回收用于后面的连接。
3）再次，确认连接体系没有问题。连接前准确定量酶切好的载体和目的片段的浓度，根据浓度配制连接体系连接，有些人很喜欢用多少ul来定量，这是非常不准确的。
4）确认感受态没有问题。
如果以上问题都解决了，一般两天就会出结果。载体pETDuet大小5.4k和目的片段1.5k应该是很好连的，祝实验顺利！
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2楼2012-04-13 19:35:47
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