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srlee

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 鼓励帮助解答,欢迎继续交流。 2012-04-13 20:09:29
zh10008100: 金币+3, 设计,保护碱基什么都有的,但是由于条件限制没有办法来估计PCR产物的量 2012-04-14 12:44:11
总是连不上,因为酶切连接涉及的过程比较多,从LZ的表述来看:
1)首先确认载体酶切没有问题。你说以前有连上好用,但建议从新酶切质粒载体回收待用。
2)其次确认连接的目的片段酶切没有问题。设计引物时有没有加保护碱基?确认内切酶没有错误?PCR产物有没有纯化?建议将PCR产物纯化回收,定量后再进行酶切1-5ugDNA,然后再过柱纯化回收用于后面的连接。
3)再次,确认连接体系没有问题。连接前准确定量酶切好的载体和目的片段的浓度,根据浓度配制连接体系连接,有些人很喜欢用多少ul来定量,这是非常不准确的。
4)确认感受态没有问题。
如果以上问题都解决了,一般两天就会出结果。载体pETDuet大小5.4k和目的片段1.5k应该是很好连的,祝实验顺利!
2楼2012-04-13 19:35:47
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